发明创造名称：一种用于动物组织基因组DNA和RNA快速提取试剂盒及提取方法和应用
外观设计名称：
决定号：181066
决定日：2019-06-06
委内编号：1F246147
优先权日：
申请（专利）号：201510333776.X
申请日：2015-06-17
复审请求人：河南省农业科学院畜牧兽医研究所
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：潘俊宇
合议组组长：曾繁辉
参审员：李美宣
国际分类号：C12N15/10
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：在判断创造性时，首先要将权利要求的技术方案和最接近的现有技术进行对比，找出二者的区别特征，确定所述技术方案实际要解决的技术问题，进而考察现有技术中是否存在将该区别特征引入到所述最接近的现有技术中以解决上述技术问题的启示，如果现有技术中存在这样的启示，则该权利要求不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201510333776.X，名称为“一种用于动物组织基因组DNA和RNA快速提取试剂盒及提取方法和应用”的发明专利申请。申请人为河南省农业科学院畜牧兽医研究所。本申请的申请日为2015年06月17日，公开日为2015年08月26日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年11月27日发出驳回决定，以权利要求1-4不具备专利法第22条第3款规定的创造性为由驳回了本发明专利申请，其具体理由是：对比文件1（CN102575220 A，公开日：2012年07月11日）公开了一种用于从生物样品中的细胞（源自患者的细胞）直接提取核酸的化学裂解组合物，该组合物包括：1M Tris-HCl，0.5M NaCl，1% Trition X-100（即聚乙二醇辛基苯基醚）（参见说明书第46-48段），其中Tris-HCl和NaCl构成检验相容性缓冲剂，其中Tris-HCl是缓冲剂组分，而NaCl是金属盐组分（参见说明书第15-17段）。权利要求1与对比文件1相比，其区别在于：（1）权利要求1进一步将裂解液（相当于对比文件1公开的直接化学裂解组合物）与冲洗液1和2、无水乙醇以及特定浓度（重量比为0.5-1.5%）的焦碳酸二乙酯水溶液一起配制为动物组织基因组DNA和RNA的快速提取试剂盒；（2）权利要求1的裂解液中进一步添加了1-3M异硫氰酸酯成分，缓冲体系中的缓冲剂组分采用30-50 mM EDTA替代Tris-HCl；（3）限定了使用该试剂盒的方法和具体步骤。基于上述区别，权利要求1实际解决的技术问题是提供一种配方完整的用于动物组织基因组DNA和RNA的快速提取试剂盒及使用方法。对于区别特征（1）：基于本领域的常规知识，对比文件1公开的用于患者细胞核酸直接提取的直接化学裂解的组合物可用于动物组织基因组的DNA和RNA快速提取。进一步地，根据所要生产的用于动物组织基因组的DNA和RNA提取的试剂盒产品类型的具体需要，除裂解液活性成分之外，本领域技术人员可在该试剂盒产品中进一步添加其他成分，包括例如：一种或更多种冲洗液（例如本申请权利要求1中的冲洗液1和2）以实现除杂作用，还可以添加无水乙醇以实现沉淀核酸溶液中的DNA和RNA的作用以及焦碳酸二乙酯水溶液以实现抑制RNase酶活性防止RNA降解的作用，这样的其他成分的添加属于本领域的常规技术手段，并且所添加的这些其他成分的特定含量/浓度范围以及冲洗液1和2的特定的pH值也可由本领域技术人员根据需要而能容易地确定。对于区别特征（2）：尽管权利要求1的裂解液中还额外添加了1-3M异硫氰酸酯成分，但是无论是基于本申请说明书的记载内容，还是根据本领域的公知常识以及本领域的现有技术，都没有证据表明异硫氰酸酯在动物制品DNA和RNA的裂解提取过程中能起任何直接作用，也没有证据表明异硫氰酸酯能与本申请权利要求1所述裂解液中的其他成分（EDTA，聚乙二醇辛基苯基醚、氯化钠）起间接作用（例如协同增效稳定的作用），换言之，异硫氰酸酯在本申请权利要求1的裂解液中不起任何功能作用，因此，其添加是本领域技术人员能容易想到的。进一步地，本领域技术人员知晓EDTA为一种常见的生物化学用途的pH缓冲剂，在提取核酸的过程中经常在溶液中加入EDTA避免DNA降解，因此有动机采用EDTA替代对比文件1中的Tris-HCl，且EDTA的浓度范围选择（30-50 mM）也属于本领域的常规选择。对于区别特征（3）：利用试剂盒提取动物组织基因组的方法及其步骤均是本领域技术人员基于特定组成的动物组织基因组DNA和RNA提取试剂盒产品而可采用的常规操作步骤，这些操作步骤都是本领域的常规技术手段。因此在对比文件1的基础上结合本领域的常用技术手段以获得权利要求1所要求保护的技术方案，对于所述技术领域的技术人员来说是显而易见的，因此权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。同理，权利要求4不具备专利法第22条第3款规定的创造性。从属权利要求2和3引用权利要求1，其附加技术特征是本领域常规技术，因此，在权利要求1不具备创造性的情况下，权利要求2和3也不具备创造性。驳回决定所依据的文本为申请日提交的说明书摘要、说明书第1-30段；2017年09月18日提交的权利要求第1-4项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种用于动物组织基因组DNA和RNA的快速提取试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下试剂：裂解液、冲洗液1、冲洗液2、无水乙醇和重量比为0.5~1.5%的焦碳酸二乙酯水溶液，其中裂解液、冲洗液1、冲洗液2的组成分别为：
（1）裂解液：EDTA 30~50 mM，重量比1~3%的聚乙二醇辛基苯基醚，异硫氰酸酯1~3 M，0.5~0.9 M氯化钠；
（2）冲洗液1：5~15 mM EDTA，体积比70%的乙醇，pH 7.0；
（3）冲洗液2：含有65~85 mM Tris-HCl，体积比80%的乙醇，pH 7.0；
利用试剂盒提取动物基因组的方法包括以下步骤：
（1）将固体状的动物组织先进行研磨处理，液体状的动物组织直接用于提取；
（1）取液体状动物组织20 μl~100 μl，或取研磨后的固体状动物组织20mg~100 mg，加500 μl 裂解液，70℃水浴3-5 min，12000 rpm 30 S，分离出上清液；
（2）将上清液转入离心管中，加500 μl 无水乙醇，分次转到DNA和RNA纯化柱上，12000 rpm 离心30 S；得到粗提的DNA和RNA ，倒掉收集管中的废液；
（3）用500 μl 冲洗液1冲洗纯化柱 ，12000 rpm离心30 S，倒掉收集管中的废液；
（4）用600 μl 冲洗液2冲洗纯化柱，12000 rpm 离心30 S，倒掉收集管中的废液；
（5）用500 μl 冲洗液2冲洗纯化柱，12000 rpm离心30 S，倒掉收集管中的废液；
（6） 再次12000 离心30 S ；
（7）将DNA和RNA纯化柱转到另一离心管，加50 μl 焦碳酸二乙酯水溶液，12000 rpm 离心30 S，即可得病毒及组织基因组的DNA和RNA，于-20 ℃保存备用。
2. 根据权利要求1所述的用于动物组织基因组DNA和RNA的快速提取试剂盒，其特征在于，其中：焦碳酸二乙酯水溶液的浓度为1%；
裂解液：EDTA 40 mM，重量比2%的聚乙二醇辛基苯基醚，异硫氰酸酯2 M，0.7 M 氯化钠；
冲洗液1：10 mM EDTA，体积比70%的乙醇，pH 7.0；
冲洗液2：含有75 mM Tris-HCl，体积比80%的乙醇，pH 7.0。
3. 根据权利要求1所述的用于动物组织基因组DNA和RNA的快速提取试剂盒，其特征在于，所述固体状的动物组织为心脏、肝脏、肺脏、脾脏或肾脏；所述液体状的动物组织为全血、血浆、血清或动物分泌物。
4. 权利要求1所述的试剂盒在用于动物组织基因组DNA和RNA快速提取中的应用。”
申请人河南省农业科学院畜牧兽医研究所（下称复审请求人）对上述驳回决定不服,于2018年03月07日向国家知识产权局提出了复审请求和经修改的权利要求书（共1页5项）。复审请求人认为: 1.本发明用于组织提取，组织杂质多（大量蛋白质、盐类及杂质），难以分离。对比文件1用于细胞提取，虽然提及还包括血液样品（组织的下位概念）、生物样品（动物组织样品的上位概念）、环境样品、食物或水样品（也存在大量蛋白质、盐类及杂质），但实施例仅用于细胞贮液；所述四种样品的杂质种类和数量均差异巨大，不同类型样品的DNA和RNA提取方法都不相同，如动物组织的DNA和RNA提取关键是除去多糖、磷脂、肝素、蛋白质、盐类、肌肉、脂肪组织等杂质。对比文件1细胞以外的范围有夸大，且无实验结果证实。2.关于裂解液，（1）对于异硫氰酸酯，其是具有RN=C=S的化合物，R为脂肪基，是稳定的具有裂解挥发性的物质；复审请求人认为异硫氰酸酯不止一种裂解条件，其裂解作用在组织核酸提取中是必要的。且即便机理不明，本发明添加了异硫氰酸酯的裂解液仍取得了更好的裂解效果。对比文件1的裂解液未用于裂解动物组织，且其处理需要120℃温育20分钟，然后将样品在室温冷却25分钟，样品处理需要45分钟。本发明裂解液处理为70℃水浴3-5分钟，速度更快，取得了更优的实验效果。（2）对于裂解液中的Trition X-100，驳回决定中 “Trition X-100作为非离子型表面活性剂可以达到裂解组织中蛋白质的作用”的说理，Triton X-100是一种温和的非离子型去垢剂，常作为添加剂使蛋白保持稳定，尤其是膜蛋白。Triton X-100可以提高真核细胞细胞膜的通透性。因此Triton X-100不但不能达到裂解组织中蛋白质的作用，而且是使蛋白保持稳定，尤其是膜蛋白。（3）对于裂解液中的EDTA或Tris-HCl，两者所发挥的作用是不同的：i）EDTA螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用；ii）EDTA的存在，有利于动物组织裂解的作用，因为动物组织裂解的反应要求有较低的离子强度的环境。而Tris-HCl是一种缓冲系统，在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，是因为TrisH /Tris不存在金属离子的干扰作用。因此EDTA和Tris-HCl之间并不存在相互替换的关系。3.对比文件1没有公开本申请冲洗液的技术方案，现有技术也没有给出本申请提取动物组织DNA和RNA所用冲洗液的技术启示。
复审请求时新修改的权利要求书如下：
“1. 一种用于动物组织基因组DNA和RNA的快速提取试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下试剂：裂解液、冲洗液1、冲洗液2、无水乙醇和重量比为0.5~1.5%的焦碳酸二乙酯水溶液，其中裂解液、冲洗液1、冲洗液2的组成分别为：
（1）裂解液：EDTA 30~50 mM，重量比1~3%的聚乙二醇辛基苯基醚，异硫氰酸酯1~3 M，0.5~0.9 M氯化钠；
（2）冲洗液1：5~15 mM EDTA，体积比70%的乙醇，pH 7.0；
（3）冲洗液2：含有65~85 mM Tris-HCl，体积比80%的乙醇，pH 7.0。
2. 根据权利要求1所述的用于动物组织基因组DNA和RNA的快速提取试剂盒，其特征在于，其中：焦碳酸二乙酯水溶液的浓度为1%；
裂解液：EDTA 40 mM，重量比2%的聚乙二醇辛基苯基醚，异硫氰酸酯2 M，0.7 M 氯化钠；
冲洗液1：10 mM EDTA，体积比70%的乙醇，pH 7.0；
冲洗液2：含有75 mM Tris-HCl，体积比80%的乙醇，pH 7.0。
3. 一种利用权利要求1或2所述的DNA和RNA快速提取试剂盒提取动物组织基因组的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
（1）将固体状的动物组织先进行研磨处理，液体状的动物组织直接用于提取；
（1）取液体状动物组织20 μl~100 μl，或取研磨后的固体状动物组织20mg~100 mg，加500 μl 裂解液，70℃水浴3-5 min，12000 rpm 30 S，分离出上清液；
（2）将上清液转入离心管中，加500 μl 无水乙醇，分次转到DNA和RNA纯化柱上，12000 rpm 离心30 S；得到粗提的DNA和RNA ，倒掉收集管中的废液；
（3）用500 μl 冲洗液1冲洗纯化柱 ，12000 rpm离心30 S，倒掉收集管中的废液；
（4）用600 μl 冲洗液2冲洗纯化柱，12000 rpm 离心30 S，倒掉收集管中的废液；
（5）用500 μl 冲洗液2冲洗纯化柱，12000 rpm离心30 S，倒掉收集管中的废液；
（6） 再次12000 离心30 S ；
（7）将DNA和RNA纯化柱转到另一离心管，加50 μl 焦碳酸二乙酯水溶液，12000 rpm 离心30 S，即可得病毒及组织基因组的DNA和RNA，于-20 ℃保存备用。
4. 根据权利要求3的所述DNA和RNA快速提取试剂盒提取动物组织基因组的方法，其特征在于，所述固体状的动物组织为心脏、肝脏、肺脏、脾脏或肾脏；所述液体状的动物组织为全血、血浆、血清或动物分泌物。
5. 权利要求1所述的试剂盒在用于动物组织基因组DNA和RNA快速提取中的应用。”
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年04月19日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为：对于裂解液中的异硫氰酸酯，其也称芥子油，其结构为CH3NCS，有辛辣味，基本不溶于水，有挥发性，高浓度对粘膜有强力刺激（“化学物的毒性及其环境保护参数手册”，董华模等，第590页，中国物资出版社，公开日：2009年12月31日），其具有挥发性，但现有技术中未记载该物质具有裂解作用；若将异硫氰酸酯理解为异硫氰酸各种酯的总称，其中异硫氰酸苯酯可用于降解蛋白质或多肽之间的肽键，但该降解全过程包括三个步骤，首先需在碱性条件下耦联反应，随后在强酸作用下通过断裂反应，最后转化为氨基酸，且每次只能降解一个肽键（“现代分子生物学实验技术”，卢圣栋等，第529-530页，中国协和医科大学出版社，公开日：1999年09月30日），然而本申请裂解液中的其他成分和提取DNA和RNA的步骤，也无法满足异硫氰酸酯发挥降解肽键的条件；其次，本申请说明书中也没有记载异硫氰酸酯如何在裂解液中发挥其作用；基于本领域的现有技术以及本申请说明书都没有证据表明异硫氰酸酯在动物制品DNA和RNA的裂解提取过程中能起任何直接作用，也没有证据表明异硫氰酸酯能与本申请权利要求1中的裂解液中的其他成分（EDTA，聚乙二醇辛基苯基醚、氯化钠）起间接作用例如协同增效稳定的作用。对于同时提取动物组织中的DNA和RNA，在二者提取过程中最大的区别在于，提取RNA时必须防止RNA酶的污染，由于RNA酶极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性（“分子生物学原理与应用”，张桦等，第218页，中国农业出版社，公开日2013年07月31日），本申请使用同一种方法提取DNA和RNA，其中并没有防止RNA酶污染的相关操作，因此根据本申请所记载的技术方案，本领域技术人员难以确保其提取RNA的效果。其次，关于技术效果：本领域衡量DNA和RNA纯度通常采用分光光度比值，对于DNA，纯DNA溶液的A260/280应为1.8±0.1，高于1.8则有可能有RNA污染，低于1.8则有可能蛋白质污染，对于RNA，纯RNA的A260/280比值迎接与1.7-2.0，如果比值太低说明RNA样品中污染了蛋白质或本分，如果比值太高，则提示RNA有降解（“生物技术制药实验”，王天晓等，第22页，甘肃科学技术出版社，公开日2011年04月30日）；本申请采用同样的方法，既能提取样品中的DNA ，也能提取样品中的RNA ，换言之根据该方法提取获得的样品中即包含DNA，也包含RNA，然而根据本申请实施例4以及表1和表2的记载，所提取的DNA的A260/280比值为1.80和1.81，可见其为DNA纯度高，其中不含RNA，同样的，所获得RNA纯度较好，不含DNA，该技术效果显然与申请人声称的技术效果矛盾，因此该方法的技术效果并不是申请人声称的纯度和提取率都非常好，也无法说明书本申请的裂解具有好的裂解效果。因而坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年01月31日向复审请求人发出复审通知书，指出: 对比文件1公开了一种用于从生物样品中的细胞（源自患者的细胞）直接提取核酸的化学裂解组合物（参见说明书第15-17、46-48段）。对比文件1还公开了一种用于提取核酸的诊断试剂盒，其包含上述化学裂解组合物（参见说明书第23段）。对比文件1实施例1和2中记载该发明的裂解组合物用于裂解患者细胞贮液（属于动物细胞）时，在不同温度温育20分钟后室温冷却25分钟，然后用氧化铁颗粒将样品进行改良的ViperTM XTR DNA提取程序，并用洗脱/中和缓冲剂洗脱样品的DNA，将洗脱液用于PCR，确认120℃温育的样品中实现了裂解、提取和扩增。权利要求1与对比文件1相比，其区别在于：1）权利要求1试剂盒中的裂解液还含有异硫氰酸酯1~3 M；2）权利要求1试剂盒中的裂解液还含有EDTA 30~50 mM且不含Tris-HCl；3）权利要求1的试剂盒中还含有冲洗液1、冲洗液2、无水乙醇和重量比为0.5~1.5%的焦碳酸二乙酯水溶液。本申请说明书实施例1-4中记载经研磨的动物组织在本发明裂解液中70℃水浴2 min，离心分离上清液，在收获的上清液中加入无水乙醇，转到DNA和RNA纯化柱上，并经过进一步离心和冲洗，将DNA和RNA纯化柱转到另一离心管，加50 μl 1%的DEPC水溶液后离心，获得纯化的DNA和RNA。因此，根据上述区别特征和说明书记载的内容，权利要求1的技术方案实际解决的技术问题是：提供一种适用于通过纯化柱提取动物组织的基因组DNA和RNA的试剂盒。对于区别特征1），异硫氰酸酯是本领域已知的一大类化合物，通式为R－N＝C＝S，不同种类的异硫氰酸酯物化性质不同，本发明（包括实施例）并未写明使用的具体是哪种异硫氰酸酯，加之本发明裂解液为组合物，含有多种组分，从而难以确定异硫氰酸酯在实现本发明裂解效果中做出了贡献。由于无法确定本发明裂解液中含有何种异硫氰酸酯能够在70℃水浴2分钟即实现裂解细胞的效果，因此，本领域技术人员实质上无法根据该区别特征达到本发明所述裂解时间缩短，裂解温度更低的技术效果，其没有实际解决技术问题。对于区别特征2），本领域公知，核酸提取过程中，细胞裂解是非常重要的，经典的裂解液几乎都含有去污剂和盐（如Tris、EDTA、NaCl等）（例如《转基因植物检测》，段武德主编，中国农业出版社，2009年01月第1版，参见第52页第2段）。本领域技术人员有动机从细胞裂解常用盐类中根据需要选择使用Tris还是EDTA，而根据实际情况对其具体含量进行优化属于本领域技术人员具备的应用常规试验的手段和能力。对于区别特征3），首先，本领域公知，旋转离心柱可以从生物样品中分离DNA和RNA。在原理上旋转离心柱系统通常可分为三个部分，第一部分是利用裂解液促使细胞破碎，使细胞中的核酸释放出来；第二部分是把释放的核酸特异地吸附在特定的硅载体上，这种载体只对核酸有较强的亲和力和吸附力而对其他的生化组分如蛋白、多糖、脂类则基本不吸附；第三部分是把吸附在特定载体上的核酸洗脱下来，分离得到纯化的核酸。而旋转离心柱技术的一次操作过程一般在十分钟到二十分钟不等。其纯化的DNA经检测OD260/OD280的比值一般在1.70-1.90之间，RNA产物OD260/OD280的比值一般在1.80-2.00之间。其可用于从全血、抗凝血、血清、脑脊液、分泌物、骨、软骨、动植物组织等样品中提取核酸（例如《临床基因诊断实验指南》，郑怀竞主编，北京医科大学出版社，1999年08月第1版，参见第27-34页第3.2.3节）。本领域还公知二氧化硅膜纯化柱可以同时提取DNA和RNA（例如《奶牛乳房炎》，丁伯良等主编，中国农业出版社，2011年01月第1版，参见第174页末段-第175页第1段）。且目前有多种已经商业化的核酸纯化柱，根据不同种类，在上柱前加入无水乙醇和选择含有EDTA或Tris-HCl及适宜浓度乙醇的冲洗液用于动物组织基因组DNA和RNA的提取试剂盒属于本领域技术人员具备的应用常规试验的手段和能力。其次，对于RNA的提取，焦碳酸二乙酯是RNase的抑制剂也是本领域公知的，本领技术人员有动机在提取动物组织基因组RNA的试剂盒中包含适宜浓度的焦碳酸二乙酯。因此，在对比文件1的基础上结合本领域公知常识和常规技术得到权利要求1的技术方案是显而易见的，其也未取得相较于现有技术的有益的技术效果，因此，权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。从属权利要求2引用权利要求1，其附加技术特征是本领域常规技术，因此，权利要求2也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。权利要求3要求保护一种利用权利要求1或2所述的DNA和RNA快速提取试剂盒提取动物组织基因组的方法，权利要求3与对比文件1的区别在于：1）权利要求3限定了裂解前，研磨固体状动物组织，或直接使用液体状动物组织；2）权利要求3限定了裂解步骤中，本发明试剂盒中的裂解液还含有异硫氰酸酯，且含有EDTA而不含Tris-HCl；还限定了裂解条件和时长；3）权利要求3还限定了裂解后离心、加无水乙醇、上柱、冲洗 离心等步骤及其所用试剂和条件，及焦碳酸二乙酯水溶液洗脱和保存。对于区别特征1），在裂解细胞前对固体状动物组织进行研磨是破碎动物组织和细胞的常规方法，对液体状动物组织可以无需研磨也是本领域公知的。对于区别特征2），对于裂解液组分的区别，参见评述权利要求1的区别特征1）和2）的理由。而选择适合的处理时长、温度、样品与裂解液比例等条件及裂解液组分含量的优化均属于本领域技术人员具备的应用常规试验的手段和能力。对于区别特征3），参见评述权利要求1的区别特征3）的理由。而选择适合的处理时长、离心强度、pH等条件及组分含量的优化均属于本领域技术人员具备的应用常规试验的手段和能力。因此，在对比文件1的基础上结合本领域公知常识和常规技术得到权利要求3的技术方案是显而易见的。权利要求3不具备专利法第22条第3款规定的创造性。从属权利要求4引用权利要求3，其附加技术特征是本领域常规选择，因此，权利要求4也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。权利要求5要求保护权利要求1所述的试剂盒在用于动物组织基因组DNA和RNA快速提取中的应用。由于权利要求1不具备创造性，而对比文件1的化学裂解组合物已应用于动物细胞DNA的提取，且根据前述公知常识，旋转离心柱可用于从全血、抗凝血、血清、脑脊液、分泌物、骨、软骨、动植物组织等样品中提取核酸。因此，权利要求5不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
复审请求人分别于2019年03月15日和2019年03月23日提交了意见陈述书，均未修改申请文件。复审请求人认为：（1）复审请求人声称提交了附件“异硫氰酸酯的制备及应用”，其中第11页右下3.1“异硫氰酸酯在化合物合成方面的应用”中明确指出，异硫氰酸酯分子中位于- N=C=S 中的C 有高度的亲电性, 能够与亲核试剂发生亲核加成反应。氨基、羟基、硫醇、β- 羰基、羧酸等作为亲核试剂都能与异硫氰酸酯发生亲核加成反应, 生成相应的硫脲。而裂解液只要含有异硫氰酸酯和聚乙二醇辛基苯基醚，则异硫氰酸酯与聚乙二醇辛基苯基醚的羟基会发生亲核加成反应，生成相应硫脲，而硫脲是一种高强度解聚剂，溶解疏水蛋白，具有很好的裂解作用，而不限定必须在酸碱条件下进行。而本申请的裂解时长3-5分钟相较于对比文件1温育20分钟 室温冷却25分钟，裂解效率更优。（2）对于裂解液中成分的选择，是成分间协同综合作用所决定的，并非简单的成分叠加，其浓度也是反复试验调整所得。（3）对于旋转离心柱，其与本申请的技术方案没有关系，而本申请的冲洗液与对比文件1相差很大，其成分和浓度的选择不是常规技术手段。且本领域技术人员不知晓旋转离心柱的组成，即便其组成已公开也与本申请没有可比性。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审请求人在答复复审通知书时未提交经修改的申请文件。经审查，2018年03月07日提交的权利要求第1-5项所作修改符合专利法第33条和专利法实施细则第61条第1款的规定。因此，本复审请求审查决定针对的文本与复审通知书针对的文本相同，为：申请日2015年06月17日提交的说明书摘要、说明书第1-30段(即第1-6页)，2018年03月07日提交的权利要求第1-5项。
关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
根据该款规定，在判断创造性时，首先要将权利要求的技术方案和最接近的现有技术进行对比，找出二者的区别特征，确定所述技术方案实际要解决的技术问题，进而考察现有技术中是否存在将该区别特征引入到所述最接近的现有技术中以解决上述技术问题的启示，如果现有技术中存在这样的启示，则该权利要求不具备创造性。
具体到本案，权利要求1要求保护一种用于动物组织基因组DNA和RNA的快速提取试剂盒。对比文件1公开了一种用于从生物样品中的细胞（源自患者的细胞）直接提取核酸的化学裂解组合物，该组合物包括：1M Tris-HCl，0.5M NaCl，1% Trition X-100（即聚乙二醇辛基苯基醚）（参见说明书第46-48段），其中Tris-HCl和NaCl构成检验相容性缓冲剂，其中Tris-HCl是缓冲剂组分，而NaCl是金属盐组分（参见说明书第15-17段）。对比文件1还公开了一种用于提取核酸的诊断试剂盒，其包含上述化学裂解组合物（参见说明书第23段）。对比文件1实施例1和2中记载该发明的裂解组合物用于裂解患者细胞贮液（属于动物细胞）时，在不同温度温育20分钟后室温冷却25分钟，然后用氧化铁颗粒将样品进行改良的ViperTM XTR DNA提取程序，并用洗脱/中和缓冲剂洗脱样品的DNA，将洗脱液用于PCR，确认120℃温育的样品中实现了裂解、提取和扩增。
权利要求1所要求保护的技术方案与对比文件1所公开的技术内容相比，其区别在于：1）权利要求1试剂盒中的裂解液还含有异硫氰酸酯1~3 M；2）权利要求1试剂盒中的裂解液还含有EDTA 30~50 mM且不含Tris-HCl；3）权利要求1的试剂盒中还含有冲洗液1、冲洗液2、无水乙醇和重量比为0.5~1.5%的焦碳酸二乙酯水溶液。
本申请说明书实施例1-4中记载经研磨的动物组织在本发明裂解液中70℃水浴2 min，离心分离上清液，在收获的上清液中加入无水乙醇，转到DNA和RNA纯化柱上，并经过进一步离心和冲洗，将DNA和RNA纯化柱转到另一离心管，加50 μl 1%的DEPC水溶液后离心，获得纯化的DNA和RNA。
因此，根据上述区别特征和说明书记载的内容，权利要求1的技术方案实际解决的技术问题是：提供一种适用于通过纯化柱提取动物组织的基因组DNA和RNA的试剂盒。
对于区别特征1），虽然与对比文件1相比，本发明的裂解时间缩短，裂解温度更低，但本申请裂解液中所用的异硫氰酸酯是本领域已知的一大类化合物，通式为R－N＝C＝S，不同种类的异硫氰酸酯物化性质不同，本发明（包括实施例）并未写明使用的具体是哪种异硫氰酸酯，加之本发明裂解液为组合物，含有多种组分，从而难以确定异硫氰酸酯在实现本发明裂解效果中做出了贡献。由于无法确定本发明裂解液中含有何种异硫氰酸酯能够在70℃水浴2分钟即实现裂解细胞的效果，因此，本领域技术人员实质上无法根据该区别特征达到本发明上述技术效果，其没有实际解决技术问题。
对于区别特征2），本领域公知，核酸提取过程中，细胞裂解是非常重要的，经典的裂解液几乎都含有去污剂和盐（如Tris、EDTA、NaCl等）（例如《转基因植物检测》，段武德主编，中国农业出版社，2009年01月第1版，参见第52页第2段）。本领域技术人员有动机从细胞裂解常用盐类中根据需要选择使用Tris还是EDTA，而根据实际情况对其具体含量进行优化属于本领域技术人员具备的应用常规试验的手段和能力。
对于区别特征3），首先，本领域公知，旋转离心柱可以从生物样品中分离DNA和RNA。在原理上旋转离心柱系统通常可分为三个部分，第一部分是利用裂解液促使细胞破碎，使细胞中的核酸释放出来；第二部分是把释放的核酸特异地吸附在特定的硅载体上，这种载体只对核酸有较强的亲和力和吸附力而对其他的生化组分如蛋白、多糖、脂类则基本不吸附；第三部分是把吸附在特定载体上的核酸洗脱下来，分离得到纯化的核酸。而旋转离心柱技术的一次操作过程一般在十分钟到二十分钟不等。其纯化的DNA经检测OD260/OD280的比值一般在1.70-1.90之间，RNA产物OD260/OD280的比值一般在1.80-2.00之间。其可用于从全血、抗凝血、血清、脑脊液、分泌物、骨、软骨、动植物组织等样品中提取核酸（例如《临床基因诊断实验指南》，郑怀竞主编，北京医科大学出版社，1999年08月第1版，参见第27-34页第3.2.3节）。本领域还公知二氧化硅膜纯化柱可以同时提取DNA和RNA（例如《奶牛乳房炎》，丁伯良等主编，中国农业出版社，2011年01月第1版，参见第174页末段-第175页第1段）。且目前有多种已经商业化的核酸纯化柱，根据不同种类，在上柱前加入无水乙醇和选择含有EDTA或Tris-HCl及适宜浓度乙醇的冲洗液用于动物组织基因组DNA和RNA的提取试剂盒属于本领域技术人员具备的应用常规试验的手段和能力。其次，对于RNA的提取，焦碳酸二乙酯是RNase的抑制剂也是本领域公知的，本领技术人员有动机在提取动物组织基因组RNA的试剂盒中包含适宜浓度的焦碳酸二乙酯。
因此，在对比文件1的基础上结合本领域公知常识和常规技术得到权利要求1的技术方案是显而易见的，也没有证据表明其相较于现有技术取得了有益的技术效果，因此，权利要求1不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求2引用权利要求1，其附加技术特征对试剂盒中各组分的含量进行了进一步限定。在权利要求1不具备创造性的基础上，根据实际情况对试剂盒中各组分含量的优化属于本领域技术人员具备的应用常规试验的手段和能力。因此，权利要求2也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求3要求保护一种利用权利要求1或2所述的DNA和RNA快速提取试剂盒提取动物组织基因组的方法。如评述权利要求1的意见中所述，对比文件1已经公开了一种用于从生物样品中的细胞（源自患者的细胞）直接提取核酸的化学裂解组合物；一种用于提取核酸的诊断试剂盒，其包含上述化学裂解组合物；及该发明的裂解组合物用于裂解患者细胞贮液（属于动物细胞）提取DNA的方法（参见说明书第15-17段、第23段、第46-48段，实施例1-2）。
权利要求3与对比文件1的区别在于：1）权利要求3限定了裂解前，研磨固体状动物组织，或直接使用液体状动物组织；2）权利要求3限定了裂解步骤中，本发明试剂盒中的裂解液还含有异硫氰酸酯，且含有EDTA而不含Tris-HCl；还限定了裂解条件和时长；3）权利要求3还限定了裂解后离心、加无水乙醇、上柱、冲洗 离心等步骤及其所用试剂和条件，及焦碳酸二乙酯水溶液洗脱和保存。
因此，根据上述区别特征和说明书记载的内容，权利要求3的技术方案实际解决的技术问题是：提供一种通过纯化柱提取动物组织的基因组DNA和RNA的方法。
对于区别特征1），在裂解细胞前对固体状动物组织进行研磨是破碎动物组织和细胞的常规方法，对液体状动物组织可以无需研磨也是本领域公知的。
对于区别特征2），对于裂解液组分的区别，参见评述权利要求1的区别特征1）和2）的理由。而选择适合的处理时长、温度、样品与裂解液比例等条件及裂解液组分含量的优化均属于本领域技术人员具备的应用常规试验的手段和能力。
对于区别特征3），参见评述权利要求1的区别特征3）的理由，即本领域公知，旋转离心柱可以从生物样品中分离DNA和RNA。旋转离心柱系统通常可分为细胞裂解、吸附和洗脱三个部分。其可用于从全血、骨、软骨、动植物组织等样品中提取核酸（例如《临床基因诊断实验指南》，郑怀竞主编，北京医科大学出版社，1999年08月第1版，参见第27-34页第3.2.3节）。本领域还公知二氧化硅膜纯化柱可以同时提取DNA和RNA（例如《奶牛乳房炎》，丁伯良等主编，中国农业出版社，2011年01月第1版，参见第174页末段-第175页第1段）。且目前有多种已经商业化的核酸纯化柱，根据不同种类，在上柱前加入无水乙醇和选择含有EDTA或Tris-HCl及适宜浓度乙醇的冲洗液用于动物组织基因组DNA和RNA的提取试剂盒属于本领域技术人员具备的应用常规试验的手段和能力。其次，对于RNA的提取，焦碳酸二乙酯是RNase的抑制剂也是本领域公知的，本领技术人员有动机在RNA洗脱液中包含适宜浓度的焦碳酸二乙酯。而选择适合的处理时长、离心强度、pH等条件及组分含量的优化均属于本领域技术人员具备的应用常规试验的手段和能力。
因此，在对比文件1的基础上结合本领域公知常识和常规技术得到权利要求3的技术方案是显而易见的，也没有证据表明其相较于现有技术取得了有益的技术效果，因此，权利要求3不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求4引用权利要求3，其附加技术特征进一步限定了组织种类。在权利要求3不具备创造性的基础上，上述组织均为本领域提取动物基因组核酸的常用组织，因此，权利要求4也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求5要求保护权利要求1所述的试剂盒在用于动物组织基因组DNA和RNA快速提取中的应用。由于权利要求1不具备创造性，而对比文件1的化学裂解组合物已应用于动物细胞DNA的提取，且根据前述公知常识，旋转离心柱可用于从全血、抗凝血、血清、脑脊液、分泌物、骨、软骨、动植物组织等样品中提取核酸；从而，本领域技术人员有动机将权利要求1的试剂盒用于动物组织基因组DNA和RNA的提取应用。因此，权利要求5不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
对于复审请求人的意见陈述，合议组认为：（1）本申请裂解液中所用的异硫氰酸酯是本领域已知的一大类化合物，通式为R－N＝C＝S，不同种类的异硫氰酸酯物化性质不同，例如异硫氰酸-1-萘酯不溶于水，异硫氰酸对氯苯酯遇光及空气反应；而异硫氰酸苯酯虽然可用于降解蛋白质或多肽之间的肽键，但该降解全过程包括三个步骤，首先需在碱性条件下耦联反应生成PTC-肽，随后在强酸作用下使肽键断裂形成ATZ衍生物从而逐一降解N末端的氨基酸（《现代分子生物学实验技术（第二版）》，卢圣栋主编，第529-530页，中国协和医科大学出版社，1999年12月第一版）。可见不同种类的异硫氰酸酯物化性质存在差异，其能够反应生成硫脲的条件也不相同。复审请求人实际上并未提交所声称的附件“异硫氰酸酯的制备及应用”，合议组根据该篇名、引用的页数和小节标题的对应关系，检索到一篇期刊文献：“异硫氰酸酯的制备及应用”（袁露等，《精细化工中间体》，第37卷第6期，第10-13页，公开日：2007年12月）；其中复审请求人引用的相关内容仅记载了异硫氰酸酯能与亲核试剂反应生成硫脲，其并不能证明任意种类的异硫氰酸酯在本发明裂解液条件下均一定能够与聚乙二醇辛基苯基醚的羟基发生反应生成硫脲。而对于本发明裂解效果，如前所述，由于无法确定本发明裂解液中含有何种异硫氰酸酯能够在70℃水浴2分钟即实现裂解细胞的效果，因此，本领域技术人员实质上无法根据异硫氰酸酯这一区别特征达到本发明上述技术效果。（2）如前所述，本领域公知核酸提取过程中，细胞裂解是非常重要的，经典的裂解液几乎都含有去污剂和盐（如Tris、EDTA、NaCl等）（例如《转基因植物检测》，段武德主编，中国农业出版社，2009年01月第1版，参见第52页第2段）。根据上述本领域公知常识，裂解液中含有盐是经典的组分，本领域技术人员有动机根据需要从常用的盐中选择不同的具体种类进行替代，并应用常规试验确定适宜的浓度。本申请也没有提供证据表明本发明裂解液中的成分之间具有协同作用。（3）本申请全文均未记载所用“DNA和RNA纯化柱”具体为何种材料，本领域技术人员可以认为其保护范围包含了本领域公知的旋转离心柱。而复审通知书中已经写明了本领域公知旋转离心柱系统可分为细胞裂解、吸附和洗脱三个部分（例如《临床基因诊断实验指南》，郑怀竞主编，北京医科大学出版社，1999年08月第1版，参见第27-34页第3.2.3节）。因此，本领域技术人员完全有动机在对比文件1的裂解液的基础上进行改进获得适用于纯化柱提取动物组织的基因组DNA和RNA的裂解液；并且根据目前有多种已经商业化的核酸纯化柱（如QIAGEN?），根据不同种类，在上柱前加入无水乙醇和选择含有EDTA或Tris-HCl及适宜浓度乙醇的冲洗液。
综上所述，复审请求人关于权利要求1-5具备专利法第22条第3款规定的创造性的理由不能成立。
根据以上事实和理由，本案合议组做出如下审查决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2017年11月27日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服,根据专利法第41条第2款的规定,复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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