发明创造名称：一种测定龙葵中总生物碱含量的方法
外观设计名称：
决定号：188808
决定日：2019-09-04
委内编号：1F260193
优先权日：
申请（专利）号：201510534497.X
申请日：2015-08-27
复审请求人：嘉兴学院
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：张艳艳
合议组组长：王艳妮
参审员：冉小燕
国际分类号：G01N21/33
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果一项权利要求与作为最接近现有技术的对比文件相比具有区别技术特征，其中部分区别技术特征被其他对比文件公开，部分区别技术特征属于本领域公知常识，则该权利要求不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201510534497.X，名称为“一种测定龙葵中总生物碱含量的方法”的发明专利申请（下称本申请）。申请人为嘉兴学院。本申请的申请日为2015年08月27日，公开日为2015年12月02日。
经实质审查，国家知识产权局专利实质审查部门于2018年07月03日发出驳回决定，驳回了本申请，其理由是：权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性，并在其他说明指出权利要求2-3不具备专利法第22条第3款规定的创造性。驳回决定所依据的文本为：申请日2015年08月27日提交的说明书附图第1页、说明书摘要；2015年10月27日提交的经初审审查员依职权修改的说明书第1-7页；2018年03月12日提交的权利要求第1-3项。驳回决定中引用了如下对比文件：
对比文件1：“超声辅助乙醇提取龙葵生物总碱的研究”，栾国颜 等，吉林化工学院学报，第27卷第4期，第4-8页，公开日为2010年08月31日；
对比文件2：“分光光度法测定伏毛铁棒锤总生物碱的含量”，折改梅 等，北京中医药大学学报，第33卷第8期，第555-558页，公开日为2010年08月31日；
对比文件3：“龙葵生物碱体外抑制肿瘤细胞增殖作用的实验研究”，黄越燕 等，亚太传统医药，第8卷第9期，第31-33页，公开日为2012年09月30日。
在实质审查过程的通知书中还采用了如下对比文件，作为公知常识的举证：
对比文件4：“一味中药祛顽疾”，李世文 等，人民军医出版社，第207页，公开日为2014年09月30日；
对比文件5：“龙葵果实生物碱成分的研究”，袁小红 等，中国保健营养（中旬刊），第5期，第150页，公开日为2013年05月31日。
驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种测定龙葵中总生物碱含量的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：精密称取干燥至恒重的龙葵碱对照品5.00mg，用氯仿溶解，超声20min，转移至50mL容量瓶，加氯仿稀释至刻度，摇匀即得0.1mg/mL的对照品储备液；
(2)标准曲线的制作：精密吸取对照品储备液于5ml量瓶中用氯仿稀释配成梯度的标准溶液，精密吸取2ml标准溶液置于分液漏斗中，加入酸性缓冲溶液及溴甲酚绿染料溶液进行显色，再加入氯仿萃取，分取氯仿层脱水处理，取上清液按照紫外分光光度法，于243nm处测定吸光度；以氯仿以相同试剂及步骤处理做空白对照；以龙葵碱含量为横坐标，以其吸光度值为纵坐标，得龙葵总生物碱含量测定标准曲线；
(3)供试品溶液的制备：精密称取已过14目筛的龙葵药材粉末2.0g，置于锥形瓶，加入体积比为1∶4的2mol/L盐酸和90％乙醇混合溶剂30mL，于40℃下超声提取35min，提取液减压回收乙醇至无醇味的浸膏，浸膏用10％盐酸溶解，超声20min助溶，抽滤去除沉淀，用10％盐酸定容至10mL，用10％NaOH调节pH至10-11，加氯仿萃取3次，收集氯仿液，定容至25ml，即得供试品溶液；
(4)样品溶液的含量测定：精密吸取供试品溶液2.0mL，按照步骤(2)中所述，加入酸性缓冲溶液及溴甲酚绿染料溶液进行显色，再加入氯仿萃取，分取氯仿层脱水处理，取上清液按照紫外分光光度法，于243nm处测定吸光度，代入标准曲线，计算得到龙葵总生物碱的含量；
其中，步骤(2)和(4)中氯仿萃取及脱水处理要求为，用10ml氯仿分三次萃取，分别是4mL、3mL、3mL，密塞剧烈振摇5min后，静置30min，取氯仿层用干燥定量滤纸过滤，加入干燥具塞并已加入0.25g无水硫酸钠的三角烧瓶中静置30min后，分取上清液。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)和(4)中酸性缓冲溶液为pH＝3.6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，加入量为3.5ml。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)和(4)中溴甲酚绿染料溶液，加入量为2ml。”
驳回决定具体指出：1）权利要求1请求保护一种测定龙葵中总生物碱含量的方法，对比文件1公开了一种测定龙葵中总生物碱含量的方法，权利要求1与对比文件1的区别在于：①在标准溶液或供试品溶液进行显色后，再加入氯仿萃取，分取氯仿层脱水处理，取上清液测定吸光度，以及氯仿萃取及脱水处理的具体要求；②使用体积比为1∶4的2 mol/L盐酸和90%乙醇混合溶剂作为龙葵药材粉末的提取溶剂，减压回收乙醇至无醇味的浸膏，浸膏用10%盐酸溶解，超声20 min助溶，抽滤去除沉淀，用10%盐酸定容至10 mL，用10%NaOH调节pH至10-11，并于氯仿萃取后将氯仿液定容至25mL；③使用龙葵碱作为对照品，相应地标准曲线的横坐标为龙葵碱含量，以及对照品溶液的具体制备过程；将移取溶液的具体方式选择为吸取，配制梯度标准溶液时定容5mL；对标准溶液和供试品溶液进行显色时，取2mL标准溶液和供试品溶液，于243nm处测定吸光度，以氯仿以相同试剂及步骤处理做空白对照；在供试品溶液制备过程中，龙葵药材粉末先过14目筛，取龙葵药材粉末2.0g，置于锥形瓶中，加入提取溶剂30mL，40℃下超声提取。对于上述区别①，对比文件2给出了如下教导：在使用酸性缓冲液和溴甲酚绿染料溶液显色测定总生物碱的方法中，在标准溶液或供试品溶液进行显色后，加入氯仿萃取，加入无水硫酸钠对氯仿层进行脱水处理，然后测定吸光度。区别①的其他区别为常规技术手段。对于上述区别②，对比文件3给出了如下技术教导：在提取龙葵生物碱时，使用体积比为1∶4的2 mol/L盐酸和90%乙醇混合溶剂作为龙葵药材粉末的提取溶剂，减压回收乙醇至浸膏，浸膏用10%盐酸溶解并过滤，滤液用氯仿萃取，弃去氯仿层，用10%NaOH调节pH至10.5-11。区别②的其他区别为常规技术手段。上述区别③为常规技术手段。因此，权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。2）在其他说明指出：权利要求2的部分附加技术特征以及权利要求3的附加技术特征被对比文件1公开，权利要求2的其他附加技术特征为常规技术手段。因此，权利要求2-3不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
申请人（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年09月02日向国家知识产权局提出了复审请求，并提交了权利要求书的全文修改替换页，修改包括：将权利要求2的附加技术特征增加到权利要求1中，删除权利要求2，并对其他权利要求的编号进行了适应性修改。复审请求人认为本申请具备创造性的理由为：（1）本申请在第[40]段记载了龙葵干燥粉末质量分别为5.001g、5.002g、5.023g、5.008g、5.006g、5.010g，平行制备6份供试品溶液，溶于氯仿定容至25mL，各精密取2mL测得的供试品含量，提取所得的生物碱总量=龙葵干燥粉末质量/2*25，即提取所得生物碱总量分别为21.0375、20.6125、21.5250、20.3000、20.9625、20.9875mg，单位质量原料得率分别为4.207、4.105、4.286、4.054、4.187、4.189mg/g，约是对比文件1中平均收率的65倍。因此，本申请的方法可以大程度地提高提取得到的生物碱总量，测试结果更准确，取得了预料不到的技术效果。（2）对比文件2公开了2g样品配置成100mL盐酸溶液，1mL样品溶液中加入8mL氯仿时测得的吸光度最大。根据对比文件2公开的内容，本领域技术人员能够显而易见知道的是：当样品质量为2g时，氯仿用量为800mL，样品的吸光度最大。本申请中将2g样品溶解于25mL氯仿，测试样品的吸光度时取2mL样品溶液加入10mL氯仿溶剂，经计算得本申请将2g样品溶解于150mL氯仿。在本申请中2g样品氯仿用量为对比文件2的3/16的情况下，不仅保证了样品的萃取率，而且吸光度仍然保持最大。对比文件2公开了取1mL样品溶液，当加入的无水硫酸钠为0.5g时，氯仿萃取液的水分脱去，吸光度最大，同时公开了减少无水硫酸钠的用量，脱水不完全，吸光度减小。对比文件2公开了2g样品配置成100mL盐酸溶液加入的无水硫酸钠总量为50g时，样品的吸光度最大。在此情况下，本领域技术人员显而易见会将2g样品溶液总加入的无水硫酸钠总量控制在50g或大于50g。本申请中将2g样品溶解于25mL氯仿，测试样品的吸光度时2mL样品溶液加入0.25g无水硫酸钠，经计算得2g样品无水硫酸钠用量为3.125g。在本申请中无水硫酸钠用量约为对比文件2中用量的1/16的情况下，保证了样品溶液中的水分完全脱去，而且吸光度仍然保持最大。（3）对比文件3提取并配置龙葵碱溶液目的是检测提取物对人肺癌A549细胞增殖的抑制作用，本申请提取并配置龙葵碱溶液是为了测定龙葵中总生物碱的含量。二者要解决的技术问题和测试方法并不相同。对比文件3在65℃加热回流提取，本申请在40℃下超声提取35min。对比文件3的加热回流法与本申请的超声提取法提取原理以及过程均不不同，不能随意替换。在对比文件3没有任何关于如何改进龙葵中总生物碱的提取方法，能够提高龙葵中总生物碱的回收率、含量测定的准确度及精确度的情况下，本领域技术人员不能显而易见知道如何改进龙葵中总生物碱的提取方法。
复审请求时提交的权利要求书如下：
“1. 一种测定龙葵中总生物碱含量的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：精密称取干燥至恒重的龙葵碱对照品5.00mg，用氯仿溶解，超声20min，转移至50mL容量瓶，加氯仿稀释至刻度，摇匀即得0.1mg/mL的对照品储备液；
(2)标准曲线的制作：精密吸取对照品储备液于5ml量瓶中用氯仿稀释配成梯度的标准溶液，精密吸取2ml标准溶液置于分液漏斗中，加入酸性缓冲溶液及溴甲酚绿染料溶液进行显色，再加入氯仿萃取，分取氯仿层脱水处理，取上清液按照紫外分光光度法，于243nm处测定吸光度；以氯仿以相同试剂及步骤处理做空白对照；以龙葵碱含量为横坐标，以其吸光度值为纵坐标，得龙葵总生物碱含量测定标准曲线；
(3)供试品溶液的制备：精密称取已过14目筛的龙葵药材粉末2.0g，置于锥形瓶，加入体积比为1∶4的2mol/L盐酸和90％乙醇混合溶剂30mL，于40℃下超声提取35min，提取液减压回收乙醇至无醇味的浸膏，浸膏用10％盐酸溶解，超声20min助溶，抽滤去除沉淀，用10％盐酸定容至10mL，用10％NaOH调节pH至10-11，加氯仿萃取3次，收集氯仿液，定容至25ml，即得供试品溶液；
(4)样品溶液的含量测定：精密吸取供试品溶液2.0mL，按照步骤(2)中所述，加入酸性缓冲溶液及溴甲酚绿染料溶液进行显色，再加入氯仿萃取，分取氯仿层脱水处理，取上清液按照紫外分光光度法，于243nm处测定吸光度，代入标准曲线，计算得到龙葵总生物碱的含量；
其中，步骤(2)和(4)中氯仿萃取及脱水处理要求为，用10ml氯仿分三次萃取，分别是4mL、3mL、3mL，密塞剧烈振摇5min后，静置30min，取氯仿层用干燥定量滤纸过滤，加入干燥具塞并已加入0.25g无水硫酸钠的三角烧瓶中静置30min后，分取上清液；
步骤(2)和(4)中所述酸性缓冲溶液为pH＝3.6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，加入量为3.5ml。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)和(4)中溴甲酚绿染料溶液，加入量为2ml。”
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年09月14日依法受理了该复审请求，并将其转送至原专利实质审查部门进行前置审查。
原专利实质审查部门在前置审查意见书中坚持驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年05月28日向复审请求人发出复审通知书，指出：1）权利要求1请求保护一种测定龙葵中总生物碱含量的方法，对比文件1公开了一种测定龙葵生物总碱（TSA）的方法，权利要求1与对比文件1的区别在于：①采用龙葵碱作为对照品，精密称取干燥至恒重的龙葵碱对照品5.00mg，用氯仿溶解，超声20min，转移至50mL容量瓶，加氯仿稀释至刻度，摇匀得0.1mg/mL的对照品储备液；②采用吸取的方式移取溶液；配制梯度标准溶液时定容至5mL；取2mL标准溶液和供试品溶液进行显色测试；在标准溶液或供试品溶液进行显色后，再加入氯仿萃取，分取氯仿层脱水处理，取上清液于243nm处测定吸光度；酸性缓冲溶液为pH＝3.6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，加入量为3.5ml；标准曲线制作以及样品溶液的含量测定时的氯仿萃取及脱水处理要求为：用10ml氯仿分三次萃取，分别是4mL、3mL、3mL，密塞剧烈振摇5min后，静置30min，取氯仿层用干燥定量滤纸过滤，加入干燥具塞并已加入0.25g无水硫酸钠的三角烧瓶中静置30min后，分取上清液；用氯仿以相同试剂及步骤处理做空白对照；③在供试品溶液制备过程中，采用的龙葵药材粉末过14目筛获取，质量为2.0g，置于锥形瓶中，加入体积比为1∶4的2mol/L盐酸和90％乙醇混合溶剂30mL，于40℃下超声提取35min，提取液减压回收乙醇至无醇味的浸膏，浸膏用10％盐酸溶解，超声20min助溶，用10％盐酸定容至10mL，用10％NaOH调节pH至10-11；萃取后的氯仿液定容至25ml。上述区别①为常用技术手段；上述区别②的部分技术特征已经被对比文件2公开，且其在对比文件2中所起的作用与其在本申请中所起的作用相同，均是用于提供一种移取溶液的方式以及提供一种用于分光光度法测定生物碱含量的酸性缓冲溶液，并保证吸光度测定的准确性。上述区别②的其他技术特征为本领域的常用技术手段；上述区别③的部分技术特征已经被对比文件3公开，且其在对比文件3中所起的作用与其在本申请中所起的作用一样，均是为了提取龙葵中的生物碱。上述区别③的部分技术特征已经被对比文件2公开，且其在对比文件2中所起的作用与其在本申请中所起的作用一样，均是为了提供一种用于制备供试品溶液的容器以及提供一种制备供试品溶液时辅助溶剂溶解的方式。上述区别③的其他技术特征为本领域的常用技术手段。因此，权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。2）权利要求2的附加技术特征已经被对比文件1公开。因此，权利要求2也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。同时针对复审请求人的意见陈述进行了回应。
复审请求人于2019年07月11日提交了意见陈述书，并提交了权利要求书的全文修改替换页，修改包括：在权利要求1中增加技术特征“所述龙葵中总生物碱含量测定的线性范围为5～30μg/mL”。复审请求人认为：（1）本申请中供试品溶液的制备过程中加入的龙葵药材粉末的质量无论是2.0g还是10.0g，最终得到的供试品溶液的体积均为25mL，测试过程中称取的体积为2.0mL。根据说明书和权利要求书记载的内容可以直接地、毫无疑义地推断出当龙葵药材粉末的质量为5.001g、5.022g、5.023g、5.008g、5.006g、5.010g时，制备的供试品溶液的体积必然也为25mL，测试过程中称取的体积也必然为2.0mL。提取所得的生物碱总量=龙葵干燥粉末质量/2*25，即提取所得生物碱总量分别为21.0375、20.6125、21.5250、20.3000、20.9625、20.9875mg，单位质量原料得率分别为4.207、4.105、4.286、4.054、4.187、4.189mg/g，约是对比文件1中平均收率的65倍。即使不按照上述计算方法，直接根据本申请说明书第[0039]-[0040]段记载的供试品量（即龙葵原料的量）和测得量（即提取所得生物碱总量），那么单位质量原料得率=测得量/供试品量，分别为0.738、0.722、0.749、0.722、0.726、0.736mg/g，约是对比文件1中平均收率的11.4倍。因此，本申请的方法可以最大程度地提高提取得到的生物碱总量，测试结果更准确，取得了预料不到的技术效果。（2）对比文件1提供的方法的线性范围为3～16μg/mL ，而本申请说明书第[0034]段明确记载了线性范围为5～30μg/mL，本申请的方法能够实现在更宽的浓度范围内测试龙葵中总碱含量。（3）在龙葵中生物碱的提取和测定过程中，加入无水硫酸钠进行干燥不是常规技术手段。对比文件2中虽然加入了无水硫酸钠，但是其是用于提取并测定伏毛铁棒锤中的生物碱，伏毛铁棒锤中的生物碱和龙葵中生物碱的种类差别很大，不同生物碱的分子结构和理化性质差别很大，在相同的溶剂中的溶解性情况不同，选取的提取方法也必然不同。在对比文件2和现有技术都没有给出伏毛铁棒锤中的生物碱含量的测定方法同样适用于测定龙葵中生物碱含量的记载和启示的情况下，本领域技术人员不会显而易见想到将对比文件2公开的测试方法应用于测定与其结构和理化性质均不同的其他种类的生物碱的含量，其技术效果是不可预期的。本申请中将2g样品溶解于25mL氯仿，测试样品的吸光度时2mL样品溶液加入0.25g无水硫酸钠，在测试过程中既保证了样品溶液中的水分完全脱去，而且吸光度仍然保持最大。（4）对比文件1第3.2.3节记载了“超声辅助乙醇提取龙葵总生物碱，与传统乙醇提取（由表4可知为乙醇浸渍提取）相比既节省时间又节约能量”。对比文件1公开的乙醇浸渍提取法与对比文件3公开的加热回流法是完全不同的提取方法。对比文件1给出的技术启示是超声提取所得的总生物碱收率高于传统的乙醇浸渍提取，而非高于加热回流法。溶解剂需要与合适的提取方式配合使用才能够提高溶解剂的提取效果。而对比文件3虽然采用了乙醇-盐酸溶液作为溶解剂，但是其具有良好的提取效果是乙醇-盐酸溶液与加热回流提取方式配合使用才得到的。在没有任何技术启示的情况下，本领域技术人员不会显而易见得到以乙醇-盐酸溶液作为溶解剂采用超声提取配合使用的技术方案，其技术效果是不可预期的。本申请将2 g样品加入体积比为1∶4的2mol/L盐酸和90％乙醇混合溶剂30mL，于40℃下超声提取35min，提取液减压回收乙醇至无醇味的浸膏，浸膏用10％盐酸溶解，超声20min助溶，抽滤去除沉淀，用10％盐酸定容至10mL，用10％NaOH调节pH至10-11，加氯仿萃取3次，收集氯仿液，定容至25ml，即得供试品溶液。
答复复审通知书时提交的权利要求书如下：
“1. 一种测定龙葵中总生物碱含量的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：精密称取干燥至恒重的龙葵碱对照品5.00mg，用氯仿溶解，超声20min，转移至50mL容量瓶，加氯仿稀释至刻度，摇匀即得0.1mg/mL的对照品储备液；
(2)标准曲线的制作：精密吸取对照品储备液于5ml量瓶中用氯仿稀释配成梯度的标准溶液，精密吸取2ml标准溶液置于分液漏斗中，加入酸性缓冲溶液及溴甲酚绿染料溶液进行显色，再加入氯仿萃取，分取氯仿层脱水处理，取上清液按照紫外分光光度法，于243nm处测定吸光度；以氯仿以相同试剂及步骤处理做空白对照；以龙葵碱含量为横坐标，以其吸光度值为纵坐标，得龙葵总生物碱含量测定标准曲线；
(3)供试品溶液的制备：精密称取已过14目筛的龙葵药材粉末2.0g，置于锥形瓶，加入体积比为1∶4的2mol/L盐酸和90％乙醇混合溶剂30mL，于40℃下超声提取35min，提取液减压回收乙醇至无醇味的浸膏，浸膏用10％盐酸溶解，超声20min助溶，抽滤去除沉淀，用10％盐酸定容至10mL，用10％NaOH调节pH至10-11，加氯仿萃取3次，收集氯仿液，定容至25ml，即得供试品溶液；
(4)样品溶液的含量测定：精密吸取供试品溶液2.0mL，按照步骤(2)中所述，加入酸性缓冲溶液及溴甲酚绿染料溶液进行显色，再加入氯仿萃取，分取氯仿层脱水处理，取上清液按照紫外分光光度法，于243nm处测定吸光度，代入标准曲线，计算得到龙葵总生物碱的含量；
其中，步骤(2)和(4)中氯仿萃取及脱水处理要求为，用10ml氯仿分三次萃取，分别是4mL、3mL、3mL，密塞剧烈振摇5min后，静置30min，取氯仿层用干燥定量滤纸过滤，加入干燥具塞并已加入0.25g无水硫酸钠的三角烧瓶中静置30min后，分取上清液；
步骤(2)和(4)中所述酸性缓冲溶液为pH＝3.6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，加入量为3.5ml；
所述龙葵中总生物碱含量测定的线性范围为5～30μg/mL。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)和(4)中溴甲酚绿染料溶液，加入量为2ml。”
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
（一）审查文本的认定
复审请求人在答复复审通知书时提交了权利要求书的全文修改替换页，经审查，所作修改符合专利法第33条的规定。本复审请求审查决定所针对的审查文本为：申请日2015年08月27日提交的说明书附图第1页、说明书摘要；2015年10月27日提交的经初审审查员依职权修改的说明书第1-7页；2019年07月11日提交的权利要求第1-2项。
（二）关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。
如果一项权利要求与作为最接近现有技术的对比文件相比具有区别技术特征，其中部分区别技术特征被其他对比文件公开，部分区别技术特征属于本领域公知常识，则该权利要求不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备创造性。
1．权利要求1请求保护一种测定龙葵中总生物碱含量的方法。对比文件1公开了一种测定龙葵生物总碱（TSA）（即，龙葵中总生物碱）的方法，并具体公开了如下技术特征（参见该对比文件第1-4节）：包括以下步骤：
标准曲线的制作：分别精密移取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL的0.4mg/mL的澳洲茄胺标准溶液（氯仿做溶剂）（即，对照品储备液）到25mL容量瓶中，定容、摇匀（即，用氯仿稀释配成梯度的标准溶液），精密移取5.0mL标准溶液置于分液漏斗中，加入2.5mL pH=4的乙酸-乙酸钠缓冲溶液（即，酸性缓冲溶液）和2.0mL溴甲酚绿指示液（即，溴甲酚绿染料溶液），萃取及显色反应完全后，静置分层，取氯仿层，移至10mL具塞试管中，利用紫外可见分光光度计在最大吸收波长处，以空白试剂作为参比，测定各样品吸光度，以澳洲茄胺含量为横坐标，以吸光度值为纵坐标，得龙葵生物总碱（TSA）含量测定标准曲线，根据图3的标准曲线可以确定样品在3～16μg/mL（与5～30μg/mL部分重叠）浓度范围内与吸光度呈良好的线性范围（参见该对比文件第3.1.3节）；
供试品溶液的制备：精密称取已过200目筛的龙葵全草粉末（即，龙葵药材粉末）5.0g，置于250mL烧瓶，加入浓度为90%的100mL乙醇溶液，采用加热回流提取或者超声辅助提取龙葵中的生物总碱（参见该对比文件第2.2节），其中，加热回流提取时，将醇提取物抽滤（即，抽滤去除杂质），保存滤液，滤渣再经过同条件提取，抽滤，保留滤液，两次滤液合并，保留提取液以备分析使用（参见该对比文件第2.2.2节）；采用同样的溶剂比、常温、超声辅助提取30min所获得的总生物碱收率高于传统乙醇提取实验：溶剂比90%、提取时间为5h、温度为40℃所获得的总生物碱收率（参见该对比文件第4节）；将提取液经减压蒸干后溶于10.0 mL的10%酸溶液中，得到生物碱的盐类化合物，再用氯仿10mL萃取除杂质，萃取三次，除去氯仿层，在酸水层里获得生物碱的盐类化合物，然后在酸水层里加入氨水或NaOH溶液调节pH值使之处于微碱性，生物碱的盐类化合物水解，再用氯仿10mL萃取，萃取三次，每次得到氯仿层样品液大约10mL左右，即得供试品溶液（参见该对比文件第3.1.2节）；
样品溶液的含量测定：精密移取供试品溶液5.0mL，按照标准曲线的制作的步骤中所述，加入2.5mL pH=4的乙酸-乙酸钠缓冲溶液及2.0mL溴甲酚绿指示液，萃取及显色反应完全后，静置分层，大约5～6h完全分层，上层显深绿色，下层（氯仿层）显黄色，取样上紫外分光光度计进行测量，在最大吸收波长处测定吸光度，代入标准曲线，计算得到龙葵生物总碱（TSA）的含量。
该权利要求请求保护的技术方案与对比文件1所公开的技术内容相比，其区别在于：①采用龙葵碱作为对照品，精密称取干燥至恒重的龙葵碱对照品5.00mg，用氯仿溶解，超声20min，转移至50mL容量瓶，加氯仿稀释至刻度，摇匀得0.1mg/mL的对照品储备液；②采用吸取的方式移取溶液；配制梯度标准溶液时定容至5mL；取2mL标准溶液和供试品溶液进行显色测试；在标准溶液或供试品溶液进行显色后，再加入氯仿萃取，分取氯仿层脱水处理，取上清液于243nm处测定吸光度；酸性缓冲溶液为pH＝3.6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，加入量为3.5ml；标准曲线制作以及样品溶液的含量测定时的氯仿萃取及脱水处理要求为：用10ml氯仿分三次萃取，分别是4mL、3mL、3mL，密塞剧烈振摇5min后，静置30min，取氯仿层用干燥定量滤纸过滤，加入干燥具塞并已加入0.25g无水硫酸钠的三角烧瓶中静置30min后，分取上清液；以氯仿以相同试剂及步骤处理做空白对照；③在供试品溶液制备过程中，采用的龙葵药材粉末过14目筛获取，质量为2.0g，置于锥形瓶中，加入体积比为1∶4的2mol/L盐酸和90％乙醇混合溶剂30mL，于40℃下超声提取35min，提取液减压回收乙醇至无醇味的浸膏，浸膏用10％盐酸溶解，超声20min助溶，用10％盐酸定容至10mL，用10％NaOH调节pH至10-11；萃取后的氯仿液定容至25ml。
基于上述区别，可以确定该权利要求相对于对比文件1实际解决的技术问题是：①选择一种替代的对照品以及提供一种对照品储备液的制备方法；②提供一种移取溶液的方式以及一种替代的酸性缓冲溶液，如何保证吸光度测定的准确性，以及如何选择试验参数；③提供一种替代的龙葵生物碱供试品溶液的制备方法。
对于上述区别①，龙葵碱是龙葵的主要化学成分，采用龙葵碱代替对比文件1中的澳洲茄胺作为龙葵中总生物碱含量测定的对照品，可以由本领域技术人员根据实际需要通过常规选择获得。将一定质量的干燥至恒重的对照品用溶剂溶解，超声混匀后转移至容量瓶，加溶剂稀释至刻度后，摇匀获得一定浓度的对照品储备溶液，属于本领域常用的对照品储备溶液制备方法，而具体采用的龙葵碱对照品质量为5.00mg，超声20min混匀，采用50mL的容量瓶定容，可以由本领域技术人员根据实际的测定需要通过常规选择获得。
对于上述区别②，对比文件2公开了一种分光光度法测定伏毛铁棒锤总生物碱含量的方法，并具体公开了如下技术特征（参见该对比文件第1-2节）：
2.2.1对照品波长的确定
精密吸取对照品溶液，置于50mL的分液漏斗中，按2.2.2项的方法操作，加入“pH=3的醋酸-醋酸钠缓冲溶液5.0mL……作为空白对照”。将对照品显色、未显色待测液和空白对照分别于200～700nm波长范围内进行光谱扫描。
2.2.2样品波长的确定
精密吸取样品溶液1.5mL，加入0.5mL氨试液，摇匀，用4mL氨水饱和的混合溶剂（乙醚：氯仿=3:1）萃取2次，每次20min，合并萃取液，低温蒸干后加入0.01mol/L 盐酸1mL、pH=3的醋酸-醋酸钠缓冲溶液5mL、溴甲酚绿指示液2mL、氯仿8mL，充分振摇均匀，静置45min分层，在下层氯仿液中加入0.5g无水硫酸钠脱水，作为样品的显色待测液；精密吸取1.5mL样品溶液，不加溴甲酚绿指示液，同法操作，作为样品的未显色待测液；另取0.01 mol/L 盐酸1mL，同法操作，作为空白对照（即，以盐酸以相同试剂及步骤处理做空白对照）；将样品显色、空白对照分别于200-700nm波长范围内进行光谱扫描（参见该对比文件第2.2.1节）；
2.4 线性关系考察
准确量取乌头碱对照品溶液0.5、0.7、1.0、1.3、1.5、1.7mL分别置于50mL的分液漏斗中，加入pH=3的醋酸-醋酸钠缓冲溶液5mL、溴甲酚绿指示液2mL、氯仿8mL，充分振摇均匀，静置45min分层，在下层氯仿液中加入0.5g无水硫酸钠脱水；另取0.01 mol/L 盐酸1mL，同法操作，作为空白对照，于416nm波长处测定其吸光度（参见该对比文件第2.4节）。
由此可见，上述区别②的部分技术特征已经被对比文件2公开，且其在对比文件2中所起的作用与其在本申请中所起的作用一样，均是用于提供一种移取溶液的方式以及提供一种用于分光光度法测定生物碱含量的酸性缓冲溶液，并保证吸光度测定的准确性。进一步地，对比文件1的对照品是以氯仿作为溶剂的，以氯仿以相同试剂及步骤处理做空白对照，对本领域技术人员而言是容易想到的；配制梯度标准溶液时定容至5mL，取2mL标准溶液和供试品溶液进行显色测试，使醋酸-醋酸钠缓冲溶液的pH＝3.6，加入量为3.5ml，可以由本领域技术人员根据实际测定需要通过常规选择获得；至于氯仿萃取及脱水处理的具体要求，将氯仿的用量调整为10mL，可以由本领域技术人员根据样品的实际情况通过常规调整获得；本领域技术人员知晓，同样量的萃取液，分少量多次萃取比全量一次萃取的效率要高，因此，将上述10mL的氯仿分别采用4 mL、3 mL、3 mL进行三次萃取，以提高萃取效率，对于本领域技术人员而言是常规的实验操作方式；加入用于萃取的氯仿后密塞剧烈振摇5 min，以保证萃取完全，静置30min后以实现氯仿分层，均属于本领域常用的萃取操作方式；氯仿的作用是萃取显色反应后溶液中的有色离子化合物，在标准溶液或供试品溶液进行显色后，再加入氯仿萃取，可以由本领域技术人员根据实际需要通过常规选择获得；通过干燥定量滤纸过滤过滤溶液以除去溶液中的杂质，属于本领域的常用技术手段，为了进一步提高实验精度，将分层后的氯仿层取出，将氯仿层用干燥定量滤纸过滤，以滤除氯仿层中可能存在的沉淀物，可以由本领域技术人员根据实际需要通过常规选择获得；在对比文件2已经教导了用无水硫酸钠对氯仿层进行脱水处理的基础上，将过滤后的氯仿层加入干燥具塞并已加入无水硫酸钠的三角烧瓶中静置一定时间后分取上清液进行吸光度测定，可以由本领域技术人员根据实际需要通过常规选择获得；无水硫酸钠的加入量以及静置时间，本领域技术人员可根据实际需要进行调整；至于吸光度的测量波长，对比文件2公开了（参见该对比文件第2.2.2 节）：在200-700nm波长范围内进行光谱扫描；对照品和样品均在416nm处有最大吸收，故确定416nm为测定波长。在对比文件2的教导下，本领域技术人员有动机根据标准溶液和供试品溶液的吸收光谱图选择具有最大吸收的波长作为吸光度的测量波长。具体选择243nm作为吸光度的测量波长，可以由本领域技术人员根据实际的测试结果确定。
对于上述区别③，对比文件3公开了一种提取龙葵生物碱的方法，并具体公开了如下技术特征（参见该对比文件第2.1节）：称取定量龙葵药粉加入圆底烧瓶中，加入15倍量的2M（即，2mol/L）HCl与90％乙醇1:4(v:v)的混合溶剂，密闭浸泡12h，于65℃水浴加热回流提取２次，３h／次，合并过滤提取液，减压蒸馏回收乙醇，水浴加热浓缩至浸膏，加10% HCl溶液溶解过滤，滤液用氯仿萃取，弃去氯仿层，水层以10% NaOH调节pH值至10.5-11（属于10-11），冷藏4℃静置过夜，4000r/min离心30min弃去上清，收集沉淀于60℃干燥，密闭保存。由此可见，上述区别③的部分技术特征已经被对比文件3公开，且其在对比文件3中所起的作用与其在本申请中所起的作用一样，均是为了提取龙葵中的生物碱。对比文件2还公开了如下技术特征（参见该对比文件第2.1节）：样品溶液的制备：取样品粉末约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加混合溶剂（乙醚：氯仿=3:1）20mL与氨水2mL，密闭，摇匀，超声10min，放置过夜，滤过，药渣用15mL乙醚浸泡洗涤3次，每次30min，滤过，合并滤液，低温蒸干，残渣加入0.01mol/L盐酸100mL溶解。由此可见，上述区别③的部分技术特征已经被对比文件2公开，且其在对比文件2中所起的作用与其在本申请中所起的作用一样，均是为了提供一种用于制备供试品溶液的容器以及提供一种制备供试品溶液时辅助溶剂溶解的方式。进一步地，采用的龙葵药材粉末过14目筛获取，质量为2.0g，使用的提取溶剂的体积为30mL，超声20min助溶，去除沉淀后用10％盐酸定容至10mL，萃取后的氯仿液定容至25ml，可以由本领域技术人员根据实际需要通过常规选择获得；为了保证乙醇充分回收，提取液减压回收乙醇至无醇味的浸膏，对本领域技术人员而言是容易想到的；在对比文件1已经给出了超声提取所得的总生物碱收率高于加热回流法的教导的情况下，在结合对比文件3的提取方法对对比文件1的方法进行改进时，本领域技术技术人员容易想到仍采用超声提取的方式提取龙葵中的生物碱，以保证总生物碱的收率；而具体在40℃下超声提取35min，可以由本领域技术人员根据实际的提取需求通过常规选择获得。
由此可见，在对比文件1的基础上结合对比文件2、3以及本领域的常用技术手段得出权利要求1所要求保护的技术方案，对本领域技术人员来说是显而易见的，因此权利要求1所要求保护的技术方案不具有突出的实质性特点和显著的进步，因而不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
2．权利要求2是权利要求1的从属权利要求，对比文件1已经公开了（参见该对比文件第3.1.2 节，第3.1.3节）：制作标准曲线和测定样品溶液时，显色体系中加入2mL溴甲酚绿指示液（即，溴甲酚绿染料溶液）。因此，在其引用的权利要求不具备创造性时，权利要求2也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
（三）对复审请求人相关意见的评述
针对复审请求人的意见陈述，合议组认为：
（1）本申请说明书第[0007]段和第[0023]段记载的是：采用2.0g龙葵药材粉末制备供试品溶液的方法，实施例1和实施例2记载的是：采用10.0g龙葵药材粉末制备供试品溶液的方法，原说明书和权利要求书中并未记载采用其他质量龙葵药材粉末制备供试品溶液的方法，即复审请求人意见陈述中所述的“当龙葵药材粉末的质量为5.001g、5.022g、5.023g、5.008g、5.006g、5.010g时，制备的供试品溶液的体积必然也为25mL，测试过程中称取的体积也必然为2.0mL”既未明确地记载在原说明书和权利要求书中，也不能由原说明书和权利要求书所记载的内容直接地、毫无疑义地确定，因此，“单位质量原料得率分别为4.207、4.105、4.286、4.054、4.187、4.189mg/g，约是对比文件1中平均收率的65倍”缺乏依据，不具备说服力。根据本申请说明书第[0036]段可知，加样回收率试验供试验的试样的获取方式为：精密吸取已测定含量的龙葵碱供试品溶液2.0mL各6份，加入已知浓度的龙葵碱对照品溶液2.0mL。本申请说明书第[0040]段对应的是回收率试验结果，表格中给出了6个供试品量分别为：5.001g、5.002g、5.023g、5.008g、5.006g、5.010g，并给出了每份供试品中加入的对照品的量，以及加入对照品后龙葵碱的测得量。即回收率试验结果中的测得量=供试品溶液中的龙葵碱的量 对照品中龙葵碱的量，并不是复审请求人认为的“测得量即提取所得生物碱总量”，因此，“单位质量原料得率=测得量/供试品量，分别为0.738、0.722、0.749、0.722、0.726、0.736mg/g，约是对比文件1中平均收率的11.4”缺乏依据，不具备说服力。
（2）专利审查指南第二部分第三章第3.2.4节指出：对比文件公开的数值范围与上述限定的技术特征的数值范围部分重叠或者有一个共同的端点，将破坏要求保护的发明或者实用新型的新颖性。具体到本案，本申请的“线性范围为5～30μg/mL”是以连续变化的数值范围限定的技术特征，根据对比文件1的图3的标准曲线可以确定样品在3～16μg/mL浓度范围内与吸光度呈良好的线性范围（参见该对比文件第3.1.3节），即对比文件1公开的线性范围3～16μg/mL与本申请的线性范围5～30μg/mL部分重叠，即对比文件1已经公开了“线性范围5～30μg/mL”的技术特征。
（3）对比文件2中将伏毛铁棒锤中的生物碱萃取到萃取液中，其对萃取液中生物碱含量的检测采用的方式和本申请一样，均是在萃取液中加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液及溴甲酚绿指示液进行显色，再加入氯仿萃取，并在萃取后的氯仿液中加入无水硫酸钠进行脱水，然后通过对脱水后的氯仿液进行吸光度测试，进而基于测得的吸光度确定伏毛铁棒锤中的生物碱含量；并且公开了基于吸光度的试验结果确定最佳氯仿用量以及无水硫酸钠用量的方法。且其在对比文件2中所起的作用也是保证吸光度测定的准确性。在对比文件2的教导下，由于提取对象均为生物碱，为了保证吸光度测定的准确性，本领域技术人员容易想到在提取龙葵中的生物碱时也在萃取后的氯仿液中加入无水硫酸钠进行脱水。然而，由于龙葵和伏毛铁棒锤不同，本领域技术人员根据对比文件2中公开的伏毛铁棒锤的最佳氯仿用量以及无水硫酸钠用量，容易想到根据实际的试验结果确定适合于龙葵的最佳氯仿用量以及无水硫酸钠用量，这是不需要付出创造性的劳动的，其能够获得的技术效果是可以合理预期的。
（4）对比文件1对龙葵生物碱的提取采用了两种方式：乙醇溶液提取（即，传统乙醇提取方式）和超声辅助乙醇溶液提取，并比较了两种提取方式的总生物碱收率。对比文件1第2.2.1节明确记载了乙醇溶液提取的具体过程为：精密称取已过200目筛的龙葵全草粉末5.0g，置于250mL烧瓶，加入浓度为90%的100mL乙醇溶液，温度为30，40，50℃回流提取4，5，6h，将醇提取物抽滤，保存滤液，滤渣再经过同条件提取，抽滤，保留滤液，两次滤液合并，保留提取液以备分析使用。根据该乙醇溶液提取方法的提取过程可以确定其为加热回流法。对比文件1第3.2.3节中表4为超声辅助乙醇提取与乙醇提取的比较，表4中的“乙醇浸渍提取”对应的即为采用加热回流法的传统乙醇提取方式。对比文件1的第4节公开了：采用同样的溶剂比、常温、超声辅助提取30min所获得的总生物碱收率高于传统乙醇提取实验：溶剂比90%、提取时间为5h、温度为40℃所获得的总生物碱收率。即对比文件1已经公开了：超声提取所得的总生物碱收率高于加热回流法。关于供试品溶液的具体制备过程，对比文件3公开了一种提取龙葵生物碱的方法，称取定量龙葵药粉加入圆底烧瓶中，加入15倍量的2M（即，2mol/L）HCl与90％乙醇1:4(v:v)的混合溶剂，密闭浸泡12h，于65℃水浴加热回流提取２次，３h／次，合并过滤提取液，减压蒸馏回收乙醇，水浴加热浓缩至浸膏，加10% HCl溶液溶解过滤，滤液用氯仿萃取，弃去氯仿层，水层以10% NaOH调节pH值至10.5-11（属于10-11），冷藏4℃静置过夜，4000r/min离心30min弃去上清，收集沉淀于60℃干燥，密闭保存（参见该对比文件第2.1节）。且其在对比文件3中所起的作用与其在本申请中所起的作用一样，均是为了提取龙葵中的生物碱。对比文件2还公开了如下技术特征（参见该对比文件第2.1节）：样品溶液的制备：取样品粉末约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加混合溶剂（乙醚：氯仿=3:1）20mL与氨水2mL，密闭，摇匀，超声10min，放置过夜，滤过，药渣用15mL乙醚浸泡洗涤3次，每次30min，滤过，合并滤液，低温蒸干，残渣加入0.01mol/L盐酸100mL溶解。且其在对比文件2中所起的作用与其在本申请中所起的作用一样，均是为了提供一种制备供试品溶液时辅助溶剂溶解的方式。进一步地，采用的龙葵药材粉末的质量为2.0g，使用的提取溶剂的体积为30mL，超声20min助溶，去除沉淀后用10％盐酸定容至10mL，萃取后的氯仿液定容至25ml，可以由本领域技术人员根据实际需要通过常规选择获得；为了保证乙醇充分回收，提取液减压回收乙醇至无醇味的浸膏，对本领域技术人员而言是容易想到的；在对比文件1已经给出了超声提取所得的总生物碱收率高于加热回流法的教导的情况下，在结合对比文件3的提取方法对对比文件1的方法进行改进时，本领域技术技术人员容易想到仍采用超声提取的方式提取龙葵中的生物碱，以保证总生物碱的收率；而具体在40℃下超声提取35min，可以由本领域技术人员根据实际的提取需求通过常规选择获得，并不需要付出创造性的劳动，其能够获得的技术效果是可以合理预期的。
综上，复审请求人陈述的理由不具有说服力，合议组不予支持。
基于以上事实和理由，合议组作出如下决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2018年07月03日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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