发明创造名称：具有病毒感染增强性质的肽及其用途
外观设计名称：
决定号：191224
决定日：2019-09-12
委内编号：1F247579
优先权日：2011-06-30
申请（专利）号：201280041341.2
申请日：2012-06-28
复审请求人：吉尼松公司 国家科学研究中心 国家健康科学研究所
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：王翔宇
合议组组长：马振莲
参审员：李岚
国际分类号：C07K14/00，C12N15/86
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：当发明请求保护的技术方案与最接近的现有技术相比存在区别技术特征时，如果现有技术中并没有给出将上述区别技术特征应用到该最接近的现有技术以解决其技术问题的启示，并且该技术方案能产生有益的技术效果，则该权利要求所限定的技术方案具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201280041341.2，名称为“具有病毒感染增强性质的肽及其用途”的发明专利申请。申请人为吉尼松公司、国家科学研究中心和国家健康科学研究所。本申请的申请日为2012年06月28日，优先权日为2011年06月30日，公开日为2014年10月01日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年12月11日以本申请的权利要求1-52不符合专利法第22条第3款的规定为由驳回了本申请。驳回决定所依据的文本为：2014年02月25日本申请进入中国国家阶段时提交的原始国际申请文件中文译文的说明书第1-26页（即第1-240段）、说明书附图图1-图12、说明书摘要、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-12页，以及2017年07月31日提交的权利要求第1-52项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. LAH4肽或其功能性衍生物用于促进病毒或病毒载体对真核细胞的感染的体外或离体的用途，其中LAH4肽具有SEQ ID NO:1中所示的序列，且LAH4肽或其功能性衍生物具有提高病毒或病毒载体的转导效率的能力，其中功能性衍生物
-具有20到30个氨基酸的长度；
-其N-末端包含一个或多个在pH 7.4时带正电荷的氨基酸残基；和
-中心螺旋区，其选自
a)非极性螺旋，其在螺旋一侧含有疏水氨基酸残基簇并在螺旋另一侧含有连续的丙氨酸残基，所述连续的丙氨酸残基在Schiffer-Edmundson轮状表示法中定义了具有60至180°的角度；或
b)两亲螺旋，其在螺旋一侧含有疏水氨基酸残基簇并在螺旋另一侧含有2至4个组氨酸残基，其在Schiffer-Edmundson轮状表示法中定义了具有包括在120至180°之间的亲水角度。
2. 如权利要求1所述的用途，其中功能性衍生物具有20或21个氨基酸的长度。
3. 如权利要求1或2所述的用途，其中功能性衍生物的N-末端包含一个或多个在pH 7.4时带正电荷的选自赖氨酸和/或精氨酸的氨基酸残基。
4. 如权利要求1至3任一项所述的用途，其中a)非极性螺旋，其在螺旋一侧含有疏水氨基酸残基簇并在螺旋另一侧含有连续的丙氨酸残基，所述连续的丙氨酸残基在Schiffer-Edmundson轮状表示法中定义了具有140°的角度。
5. 如权利要求1至4任一项所述的用途，其中b)两亲螺旋，其在螺旋一侧含有疏水氨基酸残基簇并在螺旋另一侧含有2至4个组氨酸残基，其在Schiffer-Edmundson轮状表示法中定义了具有140°的亲水角度。
6. 如权利要求1至5任一项所述的用途，其中肽的N-末端包含1个或2个由精氨酸或赖氨酸残基提供的正电荷。
7. 如权利要求1至6任一项所述的用途，其中带正电荷的残基是N-端最末端的残基。
8. 如权利要求1至7任一项所述的用途，其中肽包括C-末端，所述C-末端包括一个或多个由精氨酸和/或赖氨酸残基提供的在pH 7.4带有正电荷的氨基酸残基。
9. 如权利要求8所述的用途，其中：
-C-末端最末端的残基是丙氨酸，并且其中位于肽的C-末端的带正电荷的氨基酸残基紧邻C-末端的丙氨酸；或
-C-端最末端的残基是一个或两个带正电荷的氨基酸。
10. 如权利要求1至9任一项所述的用途，其中中心螺旋区是如b)中所定义的两亲螺旋，并且其中在Schiffer-Edmundson轮状表示法中，所述肽在由所述组氨酸残基所定义的最小角度中的组氨酸残基之间仅包括亮氨酸或仅包括丙氨酸残基。
11. 如权利要求1所述的用途，其中肽选自SEQ ID NO:1至27。
12. 一种阳离子两亲肽，其是LAH4肽的具有20到30个氨基酸的长度的功能性衍生物，包括
-N-末端，其包括1至3个在pH 7.4时带正电荷的氨基酸残基；
-至少2个组氨酸残基，其在Schiffer-Edmundson轮状表示法中定义包括在120°至180°之间的亲水角度；
-肽中的其它氨基酸选自丙氨酸和亮氨酸残基；
其中，在Schiffer-Edmundson轮状表示法中，所述肽在由所述组氨酸残基所定义的最小角度中的最远组氨酸残基之间仅包括丙氨酸残基。
13. 如权利要求12所述的肽，其中所述阳离子两亲肽具有20或21个氨基酸的长度。
14. 如权利要求12或13所述的肽，其中所述阳离子两亲肽包括2对组氨酸残基，其在Schiffer-Edmundson轮状表示法中定义包括在120°至180°之间的亲水角度。
15. 如权利要求12至14任一项所述的肽，其中N-末端包含一个或两个在pH 7.4带正电荷的氨基酸残基。
16. 如权利要求12至15任一项所述的肽，其中所述亲水角度为140°。
17. 一种肽，其是LAH4肽的具有20到30个氨基酸的长度的功能性衍生物，包括
-N-末端，其包含一个或多个在pH 7.4带正电荷的氨基酸残基；和
-非极性螺旋，其在螺旋一侧含有疏水氨基酸残基簇并在螺旋另一侧含有连续丙氨酸残基，其在Schiffer-Edmundson轮状表示法中定义具有60至180°的角度。
18. 如权利要求17所述的肽，其中所述功能性衍生物具有20或21个氨基酸的长度。
19. 如权利要求17或18所述的肽，其中非极性螺旋在螺旋一侧含有疏水氨基酸残基簇并在螺旋另一侧含有连续丙氨酸残基，其在Schiffer-Edmundson轮状表示法中定 义具有140°的角度。
20. 一种阳离子两亲肽，其是LAH4的具有20到30个氨基酸的长度的功能性衍生物，包括
-N-末端，其包含一个或多个在pH 7.4带正电荷的氨基酸残基；
-至少2个组氨酸残基，其在Schiffer-Edmundson轮状表示法中定义包括在140°至180°之间的亲水角度；
其中，在Schiffer-Edmundson轮状表示法中，所述肽在由所述组氨酸残基所定义的最小角度中的最远组氨酸残基之间仅包括亮氨酸残基，
不包括以下肽:序列为KKALLALALHHLALLAHLLALHLKKA(SEQ ID NO:36)和KKKKALLHLHLLALHLHLLALLALKKK(SEQ ID NO:37)。
21. 如权利要求20所述的肽，其中所述阳离子两亲肽具有20或21个氨基酸的长度。
22. 如权利要求20或21所述的肽，其中所述阳离子两亲肽包括4个组氨酸残基，其在Schiffer-Edmundson轮状表示法中定义包括在140°至180°之间的亲水角度。
23. 如权利要求20或21所述的肽，其中所述阳离子两亲肽包括4个组氨酸残基，其在Schiffer-Edmundson轮状表示法中定义140°的亲水角度。
24. 如权利要求20或21所述的肽，其中所述阳离子两亲肽包括至少2个组氨酸残基，其在Schiffer-Edmundson轮状表示法中定义140°的亲水角度。
25. 如权利要求20至24任一项所述的肽，其是SEQ ID NO:1所示的LAH4肽的异构体，其氨基酸序列由8个丙氨酸、4个组氨酸、10个亮氨酸和4个赖氨酸残基组成。
26. 一种肽，其选自SEQ ID NO:8-27。
27. 一种用病毒或病毒载体感染真核细胞的体外或离体的方法，其包括在存在如权利要求1至26任一项中所定义的LAH4肽或其功能性衍生物的情况下，将病毒或病毒载体与细胞相接触。
28. 如权利要求27所述的方法，其中细胞为造血祖细胞/造血干细胞。
29. 如权利要求27所述的方法，其中细胞为CD34 细胞。
30. 如权利要求27所述的方法，其中细胞为人CD34 细胞。
31. 一种增加病毒载体将核酸转运进靶细胞的效率的体外或离体的方法，其包括在存在如权利要求1至26任一项中所定义的LAH4肽或其功能性衍生物的情况下，将病 毒载体与靶细胞相接触，以促进核酸转运进靶细胞。
32. 如权利要求31所述的方法，其中核酸选自基因、cDNA、siRNA、shRNA或反义寡核苷酸序列。
33. 如权利要求31或32所述的方法，其中细胞为造血干细胞/造血祖细胞。
34. 如权利要求31或32所述的方法，其中细胞为CD34 细胞。
35. 如权利要求31或32所述的方法，其中细胞为人CD34 细胞。
36. 权利要求12至26任一项中所定义的LAH4肽或其功能性衍生物在制备用于诊断受试者中病毒感染的药物中的用途。
37. 具有如SEQ ID NO：1所示的序列的LAH4肽或其具有改善病毒或病毒载体转导效率的能力的功能性衍生物在制备用于在基因治疗中促进病毒或病毒载体对真核细胞的感染的药物中的用途，其中功能性衍生物：
-具有20到30个氨基酸的长度；
-其N-末端包含一个或多个在pH 7.4时带正电荷的氨基酸残基；和
-中心螺旋区，其选自
a)非极性螺旋，其在螺旋一侧含有疏水氨基酸残基簇并在螺旋另一侧含有连续的丙氨酸残基，所述连续的丙氨酸残基在Schiffer-Edmundson轮状表示法中定义了具有60至180°的角度；或
b)两亲螺旋，其在螺旋一侧含有疏水氨基酸残基簇并在螺旋另一侧含有2至4个组氨酸残基，其在Schiffer-Edmundson轮状表示法中定义了具有包括在120至180°之间的亲水角度。
38. 如权利要求37所述的用途，其中功能性衍生物具有20或21个氨基酸的长度。
39. 如权利要求37或38所述的用途，其中功能性衍生物的N-末端包含一个或多个在pH 7.4时带正电荷的选自赖氨酸和/或精氨酸的氨基酸残基。
40. 如权利要求37至39任一项所述的用途，其中a)非极性螺旋，其在螺旋一侧含有疏水氨基酸残基簇并在螺旋另一侧含有连续的丙氨酸残基，所述连续的丙氨酸残基在Schiffer-Edmundson轮状表示法中定义了具有140°的角度。
41. 如权利要求37至40任一项所述的用途，其中b)两亲螺旋，其在螺旋一侧含有疏水氨基酸残基簇并在螺旋另一侧含有2至4个组氨酸残基，其在Schiffer-Edmundson轮状表示法中定义了具有140°的亲水角度。
42. 如权利要求37所示的用途，其中肽的N-末端包含1个或2个由精氨酸或赖氨酸残基提供的正电荷。
43. 如权利要求37至42任一项所述的用途，其中带正电荷的残基是N-端最末端的残基。
44. 如权利要求37至43任一项所述的用途，其中肽包括C-末端，所述C-末端包括一个或多个由精氨酸和/或赖氨酸残基提供的在pH 7.4带有正电荷的氨基酸残基。
45. 如权利要求43至44任一项所述的用途，其中：
-C-末端最末端的残基是丙氨酸，并且其中位于肽的C-末端的带正电荷的氨基酸残基紧邻C-末端的丙氨酸；或-C-端最末端的残基是一个或两个带正电荷的氨基酸。
46. 如权利要求37至45任一项所述的用途，其中中心螺旋区是如b)中所定义的两亲螺旋，并且其中在Schiffer-Edmundson轮状表示法中，所述肽在由所述组氨酸残基所定义的最小角度中的组氨酸残基之间仅包括亮氨酸或仅包括丙氨酸残基。
47. 如权利要求37所述的用途，其中肽选自SEQ ID NO:1至27。
48. 如权利要求12至26任一项所述的肽在制备用于在基因治疗中促进病毒或病毒载体对真核细胞的感染的药物中的用途。
49. 如权利要求37至48任一项所述的用途，其用于制备用于在基因治疗中与病毒或病毒载体联合使用的药物。
50. 如权利要求1至11任一项所述的用途，其中病毒或病毒载体是包膜的病毒或病毒载体。
51. 如权利要求27至35任一项所述的方法，其中病毒或病毒载体是包膜的病毒或病毒载体。
52. 如权利要求36至49任一项所述的用途，其中病毒或病毒载体是包膜的病毒或病毒载体。”
驳回决定认为：对比文件1（WO02/096928 A2，公开日为2002年12月05日）公开两亲阳离子肽载体用于将目标物质转移到真核细胞（参见对比文件1摘要，说明书第7页第1-5行，第9页第9-10行，第12页第21-22行，第16页第22-30行，第1-5行，第21页第19行至第22页第12行，图11）。权利要求1中涉及LAH4肽的技术方案与对比文件1的区别在于，权利要求1限定病毒或病毒载体。权利要求1解决的技术问题是：将已知两亲阳离子肽载体用于病毒或病毒载体的转移。对于上述区别技术特征，对比文件2（任锦等，细胞穿膜肽作为药物载体的研究进展，《药学学报》，第45卷，第1期，第17-25页，2010年01月12日）公开了细胞穿膜肽的共同性质：具有正电荷性和两亲性，穿膜转运效率高，可以导入近乎所有的细胞，可以携带多种活性物质进入细胞；细胞穿膜肽具有强大的运载潜能，其携带的物质可以为蛋白质、多肽、DNA、化学小分子药物、寡核苷酸、肽核酸、纳米颗粒、腺病毒载体等，没有明显证据表明运载极限（参见对比文件2第18页左栏第14-19行，第20页左栏第2段）。对比文件3（Jean-Philippe Gratton等，Cell-permeable peptides improve cellular uptake and therapeutic gene delivery of replication-deficient viruses in cells and in vivo，第9卷，第3期，第357-362页，2003年03月）公开病毒感染需要病毒颗粒进入细胞之前有效地与质膜结合，该结合是通过病毒壳蛋白与宿主细胞表面受体之间的特异相互作用介导的，而病毒与质膜的受体非依赖性结合起到重要作用，其有助于病毒颗粒在细胞内吞之前到达其特异受体；一种提高病毒颗粒集中于细胞表面的方法可能是通过细胞穿膜肽，使用细胞穿膜肽可提高病毒介导的基因递送（参见对比文件3第357页右栏第1段至第358页左栏第2段）。在对比文件1教导了LAH4是两亲阳离子肽，并可以将蛋白、肽、核酸等多种目标物质转移到真核细胞的基础上，本领域技术人员结合对比文件2、3的上述教导容易想到利用LAH4促进病毒或病毒载体在体外或离体状态下对真核细胞感染，提高病毒或病毒载体的转导效率也是可以预期的。因此，权利要求1中涉及LAH4肽的技术方案不具备专利法第22条第3款规定的创造性。权利要求1中涉及功能性衍生物的技术方案与对比文件1的区别在于，（1）权利要求1限定病毒或病毒载体；（2）权利要求1限定功能性衍生物。对于区别技术特征（1），参见上文对权利要求1中涉及LAH4肽的技术方案的评述。对于区别技术特征（2），对比文件1还公开了一些LAH4的衍生物，如LAH4-L3（其序列与本申请的SEQ ID NO:7相同），而且，本领域公知，例如丙氨酸、亮氨酸等是疏水性氨基酸，而组氨酸、赖氨酸、精氨酸等是在pH中性时带正电荷的氨基酸，本领域技术人员容易在对比文件1的基础上设计其他两亲阳离子肽，使其具有20到30个氨基酸的长度、N-末端包含一个或多个在pH 7.4时带正电荷的氨基酸残基以及在螺旋一侧含有疏水氨基酸残基簇并在螺旋另一侧含有连续的丙氨酸残基的非极性螺旋、在螺旋一侧含有疏水氨基酸残基簇并在螺旋另一侧含有2至4个组氨酸残基的两亲螺旋，属于本领域设计两亲阳离子肽的常规选择，Schiffer-Edmundson轮状表示法是本领域表示螺旋的常规技术，本领域容易获知其所表示的亲水角度。因此，权利要求1中涉及功能性衍生物的技术方案不具备专利法第22条第3款规定的创造性。基于相似的理由，权利要求37也不符合专利法第22条第3款的规定。从属权利要求2-11、38-47的附加特征或已被对比文件1公开，或是基于对比文件1-3容易想到的；权利要求12-26请求保护肽，在对比文件1公开的肽的基础上结合本领域已知的各氨基酸的性质和两亲阳离子肽的结构特点容易获得上述肽；权利要求27请求保护一种用病毒或病毒载体感染真核细胞的体外或离体的方法，权利要求31请求保护一种增加病毒载体将核酸转运进靶细胞的效率的体外或离体的方法，基于对权利要求1-26的评述，容易获得上述方法，其从属权利要求28-30、32-35的附加技术特征均属于常规选择；权利要求36和48请求保护权利要求12至26任一项中所定义的LAH4肽或其功能性衍生物分别在制备用于诊断受试者中病毒感染和在基因治疗中促进病毒或病毒载体对真核细胞的感染的药物中的用途，基于对权利要求1的评述，结合对比文件2、3的教导容易想到具有正电荷性和两亲性的细胞穿膜肽能够促进病毒感染，并进而容易想到所述肽可在检测和在基因治疗中促进病毒感染应用；权利要求49-52的附加技术特征或是本领域的常规选择，或是在对比文件1-3的基础上可获得的。因此，在其引用的权利要求不具备创造性时，权利要求2-36、38-52不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
申请人（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年03月26日向国家知识产权局提出了复审请求，未提交修改文件和意见陈述。经形式审查合格，国家知识产权局于2018年04月17日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为，未见任何实质性意见陈述内容，因而坚持原驳回决定。
复审请求人于2019年03月15日提交了意见陈述书，认为：（1）对比文件1-3未公开LAH4肽或其衍生物促进病毒感染：对比文件1仅涉及转移蛋白质、多肽或核酸，上述物质与病毒或病毒载体在结构、理化性质和大小是根本不同的。对比文件2仅泛泛综述细胞穿膜肽，并不涉及LAH4变体，并非所有的两亲阳离子肽都能够促进腺病毒载体进入细胞，未提及或暗示所有的细胞穿膜肽都能够促进所有的所提及的物质的转移。细胞穿膜肽的机理是复杂的，且“始终是有争议的”（参见对比文件2第18页左栏第31行)：结合和内化机制依赖于CPP的性质（参见第18页左栏和右栏的骑缝段），不能预期所有的细胞穿膜肽促进病毒进入细胞；“小分子的药物不影响内化的效率, 但大分子药物, 内化效率明显降低”（参见第19页右栏第29行），因此当考虑尺寸巨大的病毒颗粒时，会预期内化受到影响；“肽的结构和对肽的构象有影响的环境因素都会对内化能力产生重要影响。肽结构的多样性，可能与它的两亲性或它的净正电荷一样是细胞自内化和其与脂质的相互作用所必需的特性”（参见第19页右栏第35-38行），表明肽结构和构象影响内化能力。由上述内容可见，本领域技术人员并不能合理地预期所有的细胞穿膜肽都具有相同的促进物质进入细胞的能力，更不用说病毒或病毒载体。对比文件3涉及研究两类具体的细胞穿膜肽，即Antp和Tat肽，与LAH4肽或其衍生物的氨基酸组成截然不同，未暗示对比文件1的LAH4肽能促进病毒进入细胞。（2）提交的附件1（“使用某些LAH4衍生物的DNA质粒转染”，共1页，中文）证实，所述修饰并未阻止LAH2-A4转染，其能够促进转染效率47%，但不能促进转导效率（参见本申请图7C），即，LAH2-A4是一种不能促进病毒进入细胞的细胞穿膜肽（它促进裸核酸的进入）。提交的附件2（“Cell-penetrating peptides: mechanism and kinetics of cargo delivery”，Zorko, M.等，Advaced Drug Delivery Reviews，2005年01月22日第57卷，第529-545页，英文，复印件共17页）公开了：“来自不同种类的CPP不分享共同的氨基酸序列基序。所有CPP的仅有的两个共同特征似乎是正电荷和两亲性”，“这并不意味着负电荷会如VT5的实例所示的那样阻止CPP内化到细胞中，VT5是携带4个负电荷以及5个正电荷的代表性模型肽，并且被有效地内化”（参见第531页左栏）。由此可知，审查员关于带正电荷的氨基酸的取代的预期影响的讨论是不相关的，带核酸的CPP并不必然是病毒CPP。（3）本发明的目的是发现新的改善病毒转导效率的解决方案，在现有技术的基础上，仅有动机制备对比文件3公开的肽的衍生物。本申请合成了多个LAH4衍生物，进行了广泛的结构-功能研究，例如，通过研究某些残基的特定作用，或通过研究在Schiffer-Edmundson轮状表示法中表示的亲水角度的重要性（参见说明书第21-22页“LAH4-A4的结构-功能研究”部分）。因此，本发明请求保护的LAH4衍生物具有创造性。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年04月09日向复审请求人发出复审通知书，指出：（1）当权利要求1请求保护的技术方案为“LAH4肽用于促进病毒载体对真核细胞的感染的体外或离体的用途”时，对比文件1公开了两亲阳离子肽载体用于将目标物质转移到真核细胞，所述肽可以是LAH4（其氨基酸序列为KKALLALALHHLAHLALHLALALKKA），所述目标物质可以是蛋白、肽或核酸；并记载了LAH4将巨细胞病毒质粒CMV-Luc（病毒载体的下位概念）转移到细胞HepG2（真核细胞的下位概念）的效果（参见摘要，说明书第7页第1-5行，说明书第9页第9-10行，第12页第21-22行，第16页第22-30行，第21页第19行至第22页第12行，图1和11）。经比对，对比文件1公开的LAH4的序列与本申请的SEQ ID NO:1完全相同，因此，权利要求1的技术方案已被对比文件1公开，其不具备专利法第22条第2款规定的新颖性。（2）对于权利要求1中涉及LAH4肽用于促进病毒对真核细胞的感染的体外或离体的用途的技术方案，其与对比文件1的区别在于，权利要求1限定了LAH4肽用于促进病毒对真核细胞的感染，而对比文件1公开了LAH4肽能够促进巨细胞病毒质粒CMV-Luc对真核细胞的感染。基于上述区别技术特征可以确定，权利要求1实际解决的技术问题是：将已知促进病毒载体转移的两亲阳离子肽用于促进病毒的转移。对于上述区别技术特征，首先，对比文件1公开了LAH4是两亲阳离子肽，并可以将蛋白、肽、核酸、病毒载体等多种目标物质转移到真核细胞。此外，对比文件3公开了病毒感染需要病毒颗粒进入细胞之前有效地与质膜结合，该结合是通过病毒壳蛋白与宿主细胞表面受体之间的特异相互作用介导的，而病毒与质膜的受体非依赖性结合起到重要作用，其有助于病毒颗粒在细胞内吞之前到达其特异受体；一种提高病毒颗粒集中于细胞表面的方法可能是通过细胞穿膜肽，使用细胞穿膜肽可提高病毒介导的基因递送（参见第357页右栏第1段至第358页左栏第2段）；由此可知，对比文件3教导了穿膜肽可以携带病毒进入细胞。在对比文件1教导了LAH4可以将包括病毒载体在内的多种目标物质转移到真核细胞的基础上，本领域技术人员结合对比文件3的教导容易想到利用LAH4促进病毒在体外或离体状态下对真核细胞的感染，提高病毒的转导效率，其效果也是可以预期的，因此权利要求1中涉及LAH4肽用于促进病毒对真核细胞的感染的体外或离体的用途的技术方案不具备专利法第22条第3款规定的创造性。对于权利要求1中涉及LAH4衍生物LAH4-L3用于促进病毒或病毒载体对真核细胞的感染的体外或离体的用途的技术方案，对比文件1还公开了LAH4衍生物LAH4-L3（参见说明书第7页第6-7行，图1，图7），经比对，其序列与本申请的SEQ ID NO:7相同，落入了权利要求1请求保护的功能性衍生物的范围内。而且对比文件1证实了该多肽具有转染HepG2的功能（参见图7），基于与评述“LAH4肽用于促进病毒或病毒载体对真核细胞的感染的体外或离体的用途”相似的理由，权利要求1中涉及LAH4-L3肽的技术方案也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。对于权利要求1中涉及除LAH4-L3（SEQ ID NO:7）以外的其他功能性衍生物的技术方案，其与对比文件1的区别在于，权利要求1限定了LAH4的功能性衍生物转导病毒或病毒载体。对比文件1公开的LAH4和LAH4-L3多肽在图1中显示了Edmundson轮状表示法定义的角度，并公开了亲水部分的组氨酸残基位于螺旋的同一侧，即与疏水部分（丙氨酸或/和亮氨酸）（参见图1）相对的一侧（参见说明书第12页第1-3行，第13页第25行-第14页第7行，图1）；而且，本领域公知，赖氨酸、精氨酸等是在pH中性时带正电荷的氨基酸，因此，本领域技术人员容易在对比文件1的基础上设计其他两亲阳离子肽，使其具有20到30个氨基酸的长度、N-末端包含一个或多个在pH 7.4时带正电荷的氨基酸残基以及在螺旋一侧含有疏水氨基酸残基簇并在螺旋另一侧含有连续的丙氨酸残基的非极性螺旋、在螺旋一侧含有疏水氨基酸残基簇并在螺旋另一侧含有2至4个组氨酸残基的两亲螺旋。同时，在对比文件1公开了LAH4和LAH4-L3多肽的Schiffer-Edmundson轮状表示法定义的角度基础上，本领域容易获知其衍生物所表示的亲水角度，并进行常规的效果验证试验，以获得具有转导病毒或病毒载体的LAH4多肽衍生物。因此，权利要求1中涉及除LAH4-L3以外的其他功能性衍生物的技术方案不具备专利法第22条第3款规定的创造性。基于相似的理由，权利要求37也不符合专利法第22条第3款的规定。从属权利要求2-11、38-47的附加特征或已被对比文件1公开，或是基于对比文件1-3容易想到的；权利要求12-26请求保护肽，在对比文件1公开的肽的基础上结合本领域已知的各氨基酸的性质和两亲阳离子肽的结构特点容易获得上述肽；权利要求27请求保护一种用病毒或病毒载体感染真核细胞的体外或离体的方法，权利要求31请求保护一种增加病毒载体将核酸转运进靶细胞的效率的体外或离体的方法，基于对权利要求1-26的评述，容易获得上述方法，其从属权利要求28-30、32-35的附加技术特征均属于常规选择；权利要求36和48请求保护权利要求12至26任一项中所定义的LAH4肽或其功能性衍生物分别在制备用于诊断受试者中病毒感染和在基因治疗中促进病毒或病毒载体对真核细胞的感染的药物中的用途，基于对权利要求1的评述，结合对比文件2、3的教导容易想到具有正电荷性和两亲性的细胞穿膜肽能够促进病毒感染，并进而容易想到所述肽可在检测和在基因治疗中促进病毒感染应用；权利要求49-52的附加技术特征或是本领域的常规选择，或是在对比文件1-3的基础上可获得的。因此，当其引用的权利要求不具备创造性时，权利要求2-36、38-52不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
复审请求人于2019年07月23日提交了意见陈述书，同时提交了权利要求书全文替换页（共1页，18项），其中将权利要求1具体限定为“如SEQ ID NO:14所示的肽”，删除原权利要求1-26、38-47，并对其他权利要求做适应性调整。复审请求人认为：对比文件1和3以及其他现有技术均未公开具有如SEQ ID NO：14所示序列的肽，本申请说明书中证实了SEQ ID NO：14所示的肽与其他LAH4肽衍生物相比，在促进病毒转导入细胞的效率方面，显著地更加有效：如图5F的结果表明，该LAH4-A4肽改进转导效率达65%，而所测试的其它肽仅改进转导效率10%至42%，因此该技术效果属于一种实质性的改进。具体而言，该LAH4-A4肽与LAH4-A3相比，仅相差3个氨基酸，肽的效率高2倍还多；如所请求保护的LAH4-A4肽比合议组所引用的LAH4-L3肽的效率高几乎5倍（见图5C和5F）；本发明请求保护的LAH4-A4肽在转导效率方面的优越性也得到了剂量反应曲线的证实（图6A），在3μg/ml和6μg/ml，LAH4-A4比LAH4-L1的效率高约4倍，在12μg/ml，LAH4-A4比LAH4-A5效率高约2倍，比LAH4-L1效率高约3倍；图12的结果也强调了LAH4-A4肽相对于其它LAH4肽衍生物的优越性，LAH4-A4肽改进了RD114TR-LV病毒的转导效率约80%；图10的结果表明，在存在LAH4-A4肽时，病毒转导比存在“SEVI”（human Semen Enhancer of Viral Infection）肽时更加高效，该“SEVI”肽先前已被公开促进慢病毒载体的转导（Wurm等人，2010）。因此，SEQ ID NO：14的肽相对于用于促进转导效率的已知肽取得了实质性的进步，本申请的技术方案具有创造性。
复审请求人于2019年08月29日再次提交了意见陈述书，同时提交了权利要求书全文替换页（共1页，17项），其中在前次修改的基础上进一步删除了权利要求14，并对其他权利要求的引用关系做适应性调整。
2019年08月29日提交的新的权利要求书如下：
“1. 一种具有如SEQ ID NO:14中所示序列的肽。
2. 如权利要求1所述的肽用于促进病毒或病毒载体对真核细胞的感染的体外或离体的用途。
3. 一种用病毒或病毒载体感染真核细胞的体外或离体的方法，其包括在存在如权利要求1所述的肽的情况下，将病毒或病毒载体与细胞相接触。
4. 如权利要求3所述的方法，其中细胞为造血祖细胞/造血干细胞。
5. 如权利要求3所述的方法，其中细胞为CD34 细胞。
6. 如权利要求3所述的方法，其中细胞为人CD34 细胞。
7. 一种增加病毒载体将核酸转运进靶细胞的效率的体外或离体的方法，其包括在存在如权利要求1所述的肽的情况下，将病毒载体与靶细胞相接触，以促进核酸转运进靶细胞。
8. 如权利要求7所述的方法，其中核酸选自基因、cDNA、siRNA、shRNA或反义寡核苷酸序列。
9. 如权利要求7或8所述的方法，其中细胞为造血干细胞/造血祖细胞。
10. 如权利要求7或8所述的方法，其中细胞为CD34 细胞。
11. 如权利要求7或8所述的方法，其中细胞为人CD34 细胞。
12. 如权利要求1所述的肽在制备用于诊断受试者中病毒感染的药物中的用途。
13. 如权利要求1所述的肽在制备用于在基因治疗中促进病毒或病毒载体对真核细胞的感染的药物中的用途。
14. 如权利要求13所述的用途，其用于制备用于在基因治疗中与病毒或病毒载体联合使用的药物。
15. 如权利要求2所述的用途，其中病毒或病毒载体是包膜的病毒或病毒载体。
16. 如权利要求3至11任一项所述的方法，其中病毒或病毒载体是包膜的病毒或病毒载体。
17. 如权利要求12至14任一项所述的用途，其中病毒或病毒载体是包膜的病毒或病毒载体。”
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
1.审查文本
复审请求人于2019年08月29日提交了权利要求书全文替换页（共1页，17项），经审查，所作修改符合专利法第33条和专利法实施细则第61条第1款的规定。因而，本复审决定针对的文本为：2014年02月25日本申请进入中国国家阶段时提交的原始国际申请文件中文译文的说明书第1-26页（即第1-240段）、说明书附图图1-图12、说明书摘要、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-12页，以及2019年08月29日提交的权利要求第1-17项。
2.专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
根据该款规定，当发明请求保护的技术方案与最接近的现有技术相比存在区别技术特征时，如果现有技术中并没有给出将上述区别技术特征应用到该最接近的现有技术以解决其技术问题的启示，并且该技术方案能产生有益的技术效果，则该权利要求所限定的技术方案具备创造性。
具体到本案，权利要求1请求保护“一种具有如SEQ ID NO:14中所示序列的肽”。对比文件1公开了两亲阳离子肽载体用于将目标物质转移到真核细胞，所述肽可以是LAH4（其氨基酸序列为KKALLALALHHLAHLALHLALALKKA），所述目标物质可以是蛋白、肽或核酸；并记载了LAH4将巨细胞病毒质粒CMV-Luc（病毒载体的下位概念）转移到细胞HepG2（真核细胞的下位概念）的效果（参见摘要，说明书第7页第1-5行，说明书第9页第9-10行，第12页第21-22行，第16页第22-30行，第21页第19行至第22页第12行，图1和11）。经比对，对比文件1公开的LAH4的序列与本申请的SEQ ID NO:1中所示的序列完全相同。对比文件1还公开了LAH4衍生物LAH4-L3（参见说明书第7页第6-7行，图1，图7），经比对，其序列与本申请的SEQ ID NO:7相同，证实了该多肽具有转染HepG2的功能（参见图7）。对比文件1公开的LAH4和LAH4-L3多肽在图1中显示了Edmundson轮状表示法定义的角度，并公开了亲水部分的组氨酸残基位于螺旋的同一侧，即与疏水部分（丙氨酸或/和亮氨酸）（参见图1）相对的一侧（参见说明书第12页第1-3行，第13页第25行-第14页第7行，图1）。权利要求1与对比文件1相比，区别特征是权利要求1限定的LAH4衍生肽的具体序列与对比文件1公开的LAH4衍生肽序列不同。权利要求1实际解决的技术问题是：提供了一种用于促进病毒或病毒载体的转移的LAH4衍生肽。对比文件2公开了细胞穿膜肽的共同性质：具有正电荷性和两亲性，穿膜转运效率高，可以导入近乎所有的细胞，可以携带多种活性物质进入细胞；细胞穿膜肽具有强大的运载潜能，其携带的物质可以为蛋白质、多肽、DNA、化学小分子药物、寡核苷酸、肽核酸、纳米颗粒、腺病毒载体等，没有明显证据表明运载极限（参见对比文件2第18页左栏第14-19行，第20页左栏第2段）。对比文件3公开了病毒感染需要病毒颗粒进入细胞之前有效地与质膜结合，该结合是通过病毒壳蛋白与宿主细胞表面受体之间的特异相互作用介导的，而病毒与质膜的受体非依赖性结合起到重要作用，其有助于病毒颗粒在细胞内吞之前到达其特异受体；一种提高病毒颗粒集中于细胞表面的方法可能是通过细胞穿膜肽，使用细胞穿膜肽可提高病毒介导的基因递送（参见第357页右栏第1段至第358页左栏第2段）。
驳回决定指出，在对比文件1教导了LAH4是两亲阳离子肽，并可以将蛋白、肽、核酸等多种目标物质转移到真核细胞的基础上，本领域技术人员结合对比文件2、3的上述教导容易想到利用LAH4促进病毒或病毒载体在体外或离体状态下对真核细胞感染，提高病毒或病毒载体的转导效率，其效果也是可以预期的；对比文件1还公开了一些LAH4的衍生物，如LAH4-L3（其序列与本申请的SEQ ID NO:7相同），而且，本领域公知，例如丙氨酸、亮氨酸等是疏水性氨基酸，而组氨酸、赖氨酸、精氨酸等是在pH中性时带正电荷的氨基酸，本领域技术人员容易在对比文件1的基础上设计其他两亲阳离子肽，使其具有20到30个氨基酸的长度、N-末端包含一个或多个在pH 7.4时带正电荷的氨基酸残基以及在螺旋一侧含有疏水氨基酸残基簇并在螺旋另一侧含有连续的丙氨酸残基的非极性螺旋、在螺旋一侧含有疏水氨基酸残基簇并在螺旋另一侧含有2至4个组氨酸残基的两亲螺旋，属于本领域设计两亲阳离子肽的常规选择，Schiffer-Edmundson轮状表示法是本领域表示螺旋的常规技术，本领域容易获知其所表示的亲水角度，因此，本申请的技术方案不具有创造性。复审通知书指出，对比文件1公开了LAH4将巨细胞病毒质粒CMV-Luc转移到细胞HepG2的效果，即教导LAH4可以促使病毒载体透细胞膜而进入真核细胞，且基于对比文件1公开了LAH4是两亲阳离子肽，其可以将蛋白、肽、核酸、病毒载体等多种目标物质转移到真核细胞，由此本领域技术人员能够合理得知LAH4是细胞穿膜肽。其次，对比文件3教导了病毒颗粒进入细胞之前需要有效地与质膜结合，细胞穿膜肽可提高病毒介导的基因递送。而本领域技术人员基于LAH4的两亲性和细胞膜的结构组成，容易知晓LAH4有助于病毒与细胞膜的结合。再次，至于LAH4衍生物，对比文件1公开了LAH4的衍生物LAH4-L3，其可以转染HepG2细胞，还公开了LAH4及其衍生物LAH4-L3的Edmundson表示法定义的角度，以及疏水性和亲水性氨基酸在螺旋空间结构中的位置（参见图1，图7），因此，本领域技术人员可在对比文件1的基础上进行设计获得相应的LAH4肽衍生物，对其效果可以通过有限的常规实验手段获得，不具有创造性。
对此，复审请求人于2019年08月29日提交的新的权利要求书中，权利要求1请求保护的技术方案已经修改为“一种具有如SEQ ID NO:14中所示序列的肽”。合议组认为，（1）虽然，本领域技术人员基于对比文件1给出的LAH4衍生肽和Edmundson轮状表示法定义的角度的技术启示，有动机选择亲水角度和一些保守氨基酸的取代；但是，对比文件1公开的LAH4-L3 （KKALLALALHHLALLAHHLALALKKA）与本申请SEQ ID NO:14所示的肽（LAH4-A4:KKALLHAALAHLLALAHHLLALLKKA）相比，共有8个氨基酸不同，对比文件1并未教导在哪个位置替换为何种氨基酸获得的衍生肽可以促进病毒或病毒载体的转移；对比文件2和3也没有教导如何获得可以促进病毒或病毒载体的转移的LAH4衍生肽；也没有证据表明对LAH4-L3进行8个氨基酸的取代可以促进病毒或病毒载体的转移是本领域的公知常识。因此，现有技术整体上没有给出对LAH4-L3进行8个氨基酸的取代可以增加其促进病毒或病毒载体的转移的技术启示。（2）从技术效果上看，根据本申请说明书的记载，LAH4-A4肽是在两对相邻组氨酸残基之间含有4个丙氨酸残基而导致140°的亲水角度的肽(图5E)，已经测试了所有这些肽的促进用GALVTR-LV转导hCD34 细胞的能力。有趣的是，在L和A系列中，最有效的肽含有140°的亲水角度，即LAH4-L4和LAH4-A4……在3和6μg/ml 时，LAH4-A4是LAH4-L1效率的约5倍且没有明显的细胞毒性(图6B)（参见说明书第21页第18-23行），在12μg/ml，LAH4-A4比LAH4-A5效率高约2倍，比LAH4-L1效率高约3倍；如图5F的结果表明，LAH4-A4肽改进转导效率达65%，而所测试的其它肽改进转导效率10%至42%；图10的结果表明，在存在LAH4-A4肽时，病毒转导比存在“SEVI”（human Semen Enhancer of Viral Infection）肽时更加高效，该“SEVI”肽先前已被公开促进慢病毒载体的转导（Wurm等人，2010），并在转导2天后没有明显的细胞毒性（参见说明书第22页第28行至第23页第4行）；图12的结果表明LAH4-A4肽改进了RD114TR-LV病毒的转导效率78.5%，相对于其它LAH4肽衍生物（6.8-19.7%）具有明显的优越性（第23页第14-28行）。由此可知，本申请说明书中证实了SEQ ID NO：14所示的肽与其他LAH4肽衍生物相比，在促进病毒转导入细胞的效率方面更加有效。因此，将具有SEQ ID NO:14的LAH4衍生物用于解决促进病毒或病毒载体的转导的问题对于本领域普通技术人员来说是非显而易见的，并且本申请权利要求1的技术方案取得了有益的技术效果。因此，权利要求1请求保护的技术方案具有创造性，符合专利法第22条第3款的规定。在权利要求1请求保护的肽具有创造性的情况下，其用于促进病毒或病毒载体对真核细胞的感染的体外或离体的用途、用病毒或病毒载体感染真核细胞的体外或离体的方法、增加病毒载体将核酸转运进靶细胞的效率的体外或离体的方法、在制备用于诊断受试者中病毒感染和在基因治疗中促进病毒或病毒载体对真核细胞的感染的药物中的用途都具有创造性，即权利要求2-17具有创造性，符合专利法第22条第3款的规定。驳回决定、前置审查意见和复审通知书的理由不再成立。
基于以上事实和理由，本案合议组作出如下审查决定。
三、决定
撤销国家知识产权局于2017年12月11日对本申请作出的驳回决定。由国家知识产权局原审查部门在本复审决定所认定的审查文本的基础上对本发明专利申请继续进行审查。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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