发明创造名称：一种高灵敏检测黄曲霉毒素的方法及其应用
外观设计名称：
决定号：183058
决定日：2019-07-08
委内编号：1F261606
优先权日：
申请（专利）号：201610216721.5
申请日：2016-04-08
复审请求人：云南健牛生物科技有限公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：崔秀艳
合议组组长：宋洁
参审员：陈飞
国际分类号：G01N30/02；G01N30/06；G01N21/64
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果一项权利要求请求保护的技术方案相对于一篇对比文件存在多个区别技术特征，其中部分区别技术特征没有被其他对比文件公开，也没有证据表明该部分区别技术特征属于本领域的公知常识，且该部分区别技术特征为该权利要求请求保护的技术方案带来了实质性改变，获得了有益的技术效果，则该权利要求相对于上述对比文件具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为2016102167215，名称为“一种高灵敏检测黄曲霉毒素的方法及其应用”的发明专利申请（下称本申请）。申请人为云南健牛生物科技有限公司。本申请的申请日为2016年04月08日，公开日为2016年06月08日。
经实质审查，国家知识产权局专利实质审查部门于2018年04月27日发出驳回决定，驳回了本申请，其理由是：权利要求1-3不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
驳回决定中使用如下对比文件：
对比文件1：“现行黄曲霉毒素液相色谱检测法的比较与评价”，王军淋等，食品安全质量检测学报，第4卷第3期，第645-654页，公开日期为：2013年6月30日；
对比文件2：“免疫亲和柱净化－柱前衍生－HPLC荧光法测定粮油食品中的黄曲霉毒素”，李永波等，中国卫生检验杂志，第24卷第17期，第2477-2480页，公开日期为：2014年9月30日。
驳回决定所依据的文本为：申请日2016年04月08日提交的说明书第1-8页、说明书摘要；2018年01月22日提交的权利要求第1-3项。
驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种高灵敏检测黄曲霉毒素的方法及其应用，其特征在于该方法包括以下步骤：
（1）工作曲线的制作：
配制黄曲霉毒素B1及 黄曲霉毒素G1混合标准溶液0.5～200ng/mL，加入一定量的衍生试剂，在紫外灯下照射一定时间进行衍生反应，在选定色谱条件下进高效液相色谱进行测定，得到黄曲霉毒素回归方程、相关系数、相对标准偏差、回收率；
（2）样品提取
① 对于大米、玉米、小麦、花生、核桃、杏仁及其制品及中药提取方法为：准确称取粉碎均质后的样品2～5g，精确至 0.0001 g，加入体积分数为70～80%的乙腈水溶液20～50 mL，剧烈振荡 1 min，50±2℃水浴超声提取20～30 min，以 3500 ～5000r/min 离心 5～10 min，取出上层溶液，重复提取2～3次，合并上清液，待用；
②对于酱油、食醋、植物油脂提取方法为：准确称取5.00～10.00g样品，加入 2～5 g NaCl和体积分数为70～80%的乙腈水溶液20～50 mL，涡旋混合1～3min，定量滤纸过滤，准确吸取 5.00 mL 滤液，加入10mL 超纯水稀释，混匀，待用；
（3）样品测定
取步骤（2）中的提取液，按照步骤（1）进行荧光衍生，在与步骤（1）相同色谱条件进行HPLC分析，并对照步骤（1）所得的线性回归方程，计算样品中黄曲霉毒素的含量；
所述的紫外灯下照射时间为5～20min；
所述食品样品中待测黄曲霉毒素包括：黄曲霉毒素 B1、G1。
2. 根据权利要求1所述的一种高灵敏检测黄曲霉毒素的方法及其应用， 其特征在于步骤（1）所述的衍生试剂包括三氟乙酸、硝酸、硫酸、盐酸中之一种，体积百分比浓度为15～25%。
3. 根据权利要求1所述的一种高灵敏检测黄曲霉毒素的方法及其应用， 其特征在于所述的设定的液相色谱条件为：C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm），流动相甲醇-水（45∶55），流速1.0 mL/min，进样量50 μL，柱温箱30℃。检测器为荧光检测器，激发波长 360 nm，发射波长 440 nm；高效液相色谱仪（配备荧光检测器）。”
驳回决定具体指出：（1）权利要求1请求保护一种高灵敏检测黄曲霉毒素的方法及其应用，对比文件1公开了黄曲霉毒素液相色谱检测法，该权利要求所要求保护的技术方案与对比文件1所公开的技术内容相比，其区别技术特征为：1）在紫外灯照射下进行衍生反应；2）标准溶液进行衍生反应，得到回归方程、相关系数、相对标准偏差、回收率，根据回归方程计算黄曲霉毒素含量；样品提取的条件有所不同。上述区别技术特征1）是本领域技术人员在对比文件1公开的内容的基础上容易想到的；上述区别技术特征2）部分特征是在对比文件1公开内容的基础上容易想到的，其余特征属于本领域的常规选择。因此，权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。（2）从属权利要求2的附加特征或者被对比文件1公开，或者属于本领域的常规选择。因此，从属权利要求2不具备专利法第22条第3款规定的创造性。（3）从属权利要求3的附加特征或者被对比文件2公开，或者属于本领域的常规选择。因此，从属权利要求3不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
申请人云南健牛生物科技有限公司（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年08月12日向国家知识产权局提出了复审请求，同时提交了权利要求书的全文修改替换页，修改涉及：将权利要求3的附加特征加入到权利要求1中，并删除了权利要求3。复审请求人认为：（1）本申请黄曲霉毒素测定是在柱前衍生反应 紫外光线照射下进行，现有技术未见任何报道。本申请的方法在线性范围及加标回收率方面远远好于对比文件2。本申请不仅线性范围宽，线性下限满足实际需求，且在加标浓度低于对比文件时，加标回收率高于对比文件，RSD也低于对比文件。经本衍生后的黄曲霉毒素B1及G1检测限可达0.1μg/kg。本申请将衍生技术的柱前衍生技术与光化学衍生技术巧妙结合，反应完全且产生的荧光强，让所获得的衍生产物荧光稳定性好，同时又提高了检测灵敏度，操作简单，时间短，效果好，产生了意想不到的技术效果。（2）关于衍生试剂，除了三氟乙酸，本申请还使用了硝酸、硫酸及盐酸，这不是本领域的常规选择，具有有益的技术效果。
提出复审请求时提交的权利要求书如下：
“1. 一种高灵敏检测黄曲霉毒素的方法及其应用，其特征在于该方法包括以下步骤：(1)工作曲线的制作：
配制黄曲霉毒素B1及黄曲霉毒素G1混合标准溶液0.5～200ng/mL，加入一定量的衍生试剂，在紫外灯下照射一定时间进行衍生反应，在选定色谱条件下进高效液相色谱进行测定，得到黄曲霉毒素回归方程、相关系数、相对标准偏差、回收率；
(2)样品提取
①对于大米、玉米、小麦、花生、核桃、杏仁及其制品及中药提取方法为：准确称取粉碎均质后的样品2～5g，精确至0.0001g，加入体积分数为70～80％的乙腈水溶液20～50mL，剧烈振荡1min，50±2℃水浴超声提取20～30min，以3500～5000r/min离心5～10min，取出上层溶液，重复提取2～3次，合并上清液，待用；
②对于酱油、食醋、植物油脂提取方法为：准确称取5.00～10.00g样品，加入2～5g NaCl和体积分数为70～80％的乙腈水溶液20～50mL，涡旋混合1～3min，定量滤纸过滤，准确吸取5.00mL滤液，加入10mL超纯水稀释，混匀，待用；
(3)样品测定
取步骤(2)中的提取液，按照步骤(1)进行荧光衍生，在与步骤(1)相同色谱条件进行HPLC分析，并对照步骤(1)所得的线性回归方程，计算样品中黄曲霉毒素的含量；
所述食品样品中待测黄曲霉毒素包括：黄曲霉毒素B1、G1；
所述的设定的液相色谱条件为：C18色谱柱(4.6mm×250mm，5.0μm)，流动相甲醇-水(45∶55)，流速1.0mL/min，进样量50μL，柱温箱30℃；
检测器为荧光检测器，激发波长360nm，发射波长440nm；配备荧光检测器的高效液相色谱仪，所述的紫外灯下照射时间为5～20min。
2. 根据权利要求1所述的一种高灵敏检测黄曲霉毒素的方法及其应用，其特征在于步骤(1)所述的衍生试剂包括三氟乙酸、硝酸、硫酸、盐酸中之一种，体积百分比浓度为15～25％。”
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年09月29日依法受理了该复审请求，并将其转送至原专利实质审查部门进行前置审查。
原专利实质审查部门在前置审查意见书中坚持驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
1、审查文本的认定
复审请求人在提交复审请求时提交了权利要求书的全文修改替换页，经查，所作修改符合专利法第33条的规定。本复审请求审查决定所针对的文本为：申请日2016年04月08日提交的说明书第1-8页、说明书摘要；2018年08月12日提交的权利要求第1-2项。
2、关于专利法第22条第3款
创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。
如果一项权利要求请求保护的技术方案相对于一篇对比文件存在多个区别技术特征，其中部分区别技术特征没有被其他对比文件公开，也没有证据表明该部分区别技术特征属于本领域的公知常识，且该部分区别技术特征给权利要求请求保护的技术方案带来了实质性改变，获得了有益的技术效果，则该权利要求相对于上述对比文件具备创造性。
（1）权利要求1具备专利法22条第3款规定的创造性。
权利要求1请求保护一种高灵敏检测黄曲霉毒素的方法及其应用，对比文件1公开了黄曲霉毒素液相色谱检测法，并具体公开了以下技术特征（参见第647-650页第1-2节）：
标准溶液的配制：将标准液用乙腈配制成含黄曲霉毒素 B1、G1、M1、M2浓度为 100 ng/mL及含黄曲霉毒素 B2、G2浓度为 25 ng/mL 的标准储备液；
样品提取
玉米样品：准确称取玉米样品 5.0 g (精确至 0.01g) 于 50 mL 离心管中，加入 20 mL 乙腈-水溶液 (84:16, v/v)，均质（属于剧烈振荡）1 min 后，超声提取 10 min，离心，取上清液供净化用；
植物油脂：准确称取油样 5.0 g (精确至 0.01 g)于50 mL 离心管中，加入 0.5 g 氯化钠，20 mL 乙腈-水溶液 (84: 16, v/v)，涡旋 2 min，离心，取上清液供净化用；
TFA柱前衍生法：将洗脱液用氮气吹干，分别加入 200 μL正己烷和 100 μL 三氟乙酸溶液，涡旋 30 s，在(40±1)℃的恒温箱中衍生 15 min，衍生结束后，氮吹干，用乙腈-水溶液(20: 80, v/v) 定容至 1 mL，涡旋 30s，过 0.22 μm 滤膜，收集滤液，进 UPLC-FLD 分析，计算得到黄曲霉毒素的含量。
该权利要求所要求保护的技术方案与对比文件1所公开的技术内容相比，其区别技术特征为：（1）在紫外灯照射下进行衍生反应；（2）标准溶液进行衍生反应，得到回归方程、相关系数、相对标准偏差、回收率，根据回归方程计算黄曲霉毒素含量；样品提取的条件有所不同；（3）液相色谱条件不同。基于上述区别技术特征，本申请实际解决的技术问题是选择合适的衍生条件、提取条件、计算方法和液相色谱条件。
对于区别技术特征（1），对比文件2公开了一种免疫亲和柱净化－柱前衍生－HPLC荧光法测定粮油食品中的黄曲霉毒素的方法，并具体公开了以下技术特征（参见第2478页1.3.2节）：收集1.5ml甲醇洗脱液于衍生瓶，洗脱液在60℃条件下氮吹仪吹干，加入200μl正己烷和100μl三氟乙酸，密闭混匀30s后，在40℃水浴箱中衍生15min。由此可见，对比文件2仅公开了柱前衍生方式，且该柱前衍生方式中并未照射紫外线。即该区别技术特征（1）未被对比文件2公开。对比文件1公开了TFA柱前衍生的原理是在三氟乙酸的作用下，黄曲霉毒素B1、G1和M1分子上的活性双键发生羟基化反应，生成荧光特性更强，更稳定的分子，可解决黄曲霉毒素B1、G1灵敏度低的现象。光化学柱后衍生，利用紫外光照射，使黄曲霉毒素B1、G1和M1分子上的活性双键发生羟基化反应，生成荧光特性更强的物质，解决了黄曲霉毒素B1、G1因灵敏度低而达不到痕量检测要求的问题（参见对比文件1第648页第2.1节和图2）。由此可见，对比文件1公开的TFA柱前衍生方法不需要照射紫外线，而柱后衍生方法中，不需要加衍生试剂，仅需要照射紫外线。即对比文件1未公开柱前衍生 紫外线照射的衍生方式。在柱前衍生方式中，采用衍生试剂已经可以解决黄曲霉毒素B1、G1灵敏度低的技术问题的基础上，本领域技术人员没有动机在柱前衍生方式中再结合柱后衍生方式。即对比文件1、2未公开该区别技术特征（1），没有给出相应的技术启示，也没有证据表明其是本领域的公知常识。且采用柱前衍生 紫外线照射的衍生方式，可以使衍生反应更完全，进而提高黄曲霉毒素B1、G1的检测灵敏度，获得了有益的技术效果。
对于区别技术特征（2），标准溶液使用与样品溶液相同的方法进行衍生是本领域的常规技术手段，回归方程、相关系数、相对标准偏差、回收率是本领域实验时通常会进行测定的参数，是本领域的常规选择，根据回归方程计算含量也是本领域的常规计算方法；对比文件1公开了玉米和植物油脂的样品提取方法，将玉米提取方法应用于与其类似的大米、小麦、花生、核桃、杏仁及其制品及中药提取中，将植物油脂提取方法应用于与其类似酱油、食醋的提取中，是本领域的常规技术手段；称取样品精确至0.0001g是本领域的常规选择，对比文件1公开的提取溶液为84%乙腈水溶液，并在第650页第2.2节说明可根据样品中水分对提取溶液的比例进行调整，本领域技术人员可根据实际实验情况调整乙腈水溶液的比例，为了提高提取效率，使用水浴是本领域的常规选择，水浴温度也是本领域的常规选择，离心速率和时间，重复提取次数是本领域技术人员的常规实验选择；加入氯化钠的量可根据实验效果进行调整，是本领域技术人员的常规技术手段，使用定量滤纸过滤、稀释是样品前处理过程的常规步骤，具体吸取滤液的量和稀释所用超纯水的量是本领域的常规选择。
对于区别技术特征（3），对比文件2公开了（参见第2478页第1节）Semetry C18柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，高效液相色谱仪器，HPLC荧光检测器：激发波长：360 nm，发射波长：440 nm。流速：1.0 ml/min，流动相：甲醇：水 =45：55；上述技术特征在对比文件2中所起的作用与其在本申请中所起的作用相同，都是用于分析测定粮油食品中的黄曲霉毒素，即该对比文件给出了将上述技术特征应用到对比文件1中以进一步解决其技术问题的启示；而进样量和柱温是本领域的常规选择。
由此可见，针对上述区别技术特征（1），本领域技术人员无法从对比文件1得到其相应的技术内容，该特征也没有被其他对比文件公开，也没有证据表明该部分区别技术特征属于本领域的公知常识，即该部分区别技术特征给权利要求请求保护的技术方案带来了实质性改变，而且取得了有益的技术效果。因此，权利要求1请求保护的技术方案相对于上述对比文件具备专利法第22条第3款规定的创造性。
（2）权利要求2具备专利法22条第3款规定的创造性。
权利要求2是权利要求1的从属权利要求。由于权利要求1具备专利法第22条第3款规定的创造性，从属权利要求2也具备专利法第22条第3款规定的创造性。
驳回决定及前置意见认为：
柱前衍生和紫外灯照射衍生的机制相同，同时使用两种手段以提高衍生反应效率，是本领域技术人员的常规选择。对比文件1说明了：柱前衍生和光化学柱后衍生的反应机制相同，均是将双呋喃环上的双键打开，使黄曲霉毒素B1、G1和M1分子上的活性双键发生羟基化反应，生成荧光特性更强的物质，为了提高衍生反应效率，本领域技术人员容易想到在TFA柱前衍生时，同时使用紫外灯照射。
对此，合议组认为：
虽然对比文件1公开的柱前衍生和柱后衍生的反应机制相同，但本领域技术人员并没有动机将两种反应机制相同的方法结合。
对比文件1公开的TFA柱前衍生方法不需要照射紫外线，而柱后衍生方法中，不需要加衍生试剂，仅需要照射紫外线。在样品中既加入衍生试剂，又照射紫外线，衍生试剂在紫外线照射条件下，是否会发生其他反应，属于本领域技术人员无法预期的内容，即柱前衍生 紫外线照射的衍生方法所达到的技术效果不属于本领域技术人员可以预期的内容。在柱前衍生方式中，采用衍生试剂已经可以解决黄曲霉毒素B1、G1灵敏度低的技术问题的基础上，本领域技术人员没有动机在柱前衍生方式中再结合柱后衍生方式。即使为了提高衍生效率，需要采用两种衍生方式，本领域技术人员容易想到的也是采用串联的方式（参见对比文件1第650页第2.1.5节PHRED光化学柱后衍生与大体积流动池串联使用），即在柱前衍生反应结束后，再进行柱后衍生。在加入衍生试剂的同时照射紫外线，不属于本领域技术人员容易想到的内容。柱前衍生 紫外线照射的衍生方式获得了衍生反应完全且荧光强，衍生产物荧光稳定性好，检测灵敏度高的有益效果。
基于上述事实和理由，合议组作出如下审查决定。
三、决定
撤销国家知识产权局于2018年04月27日对本申请作出的驳回决定。由国家知识产权局原专利实质审查部门在本复审请求审查决定所依据文本的基础上对本申请继续进行审查。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本复审请求审查决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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