发明创造名称：用于量化样品中核酸序列的组合物和方法
外观设计名称：
决定号：188050
决定日：2019-08-27
委内编号：1F240876
优先权日：2012-04-09
申请（专利）号：201380029891.7
申请日：2013-04-09
复审请求人：一龙公司 丹尼尔·谢弗 斯蒂芬·A·朱迪斯
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：邹凯
合议组组长：王亦然
参审员：李金光
国际分类号：C12Q1/68，C12Q1/00
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：?如果权利要求所要求保护的技术方案与最接近的现有技术的区别特征是相同领域其它对比文件中披露的相关的技术手段，该技术手段在该对比文件中所起的作用与该区别特征在要求保护的发明中为解决发明实际解决的技术问题所起的作用相同，则认为现有技术整体上存在改进最接近的现有技术而获得所要求保护的技术方案的启示，此时该权利要求相对于现有技术是显而易见的，不具备创造性，反之，则具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201380029891.7，名称为“用于量化样品中核酸序列的组合物和方法”的发明专利申请。申请人为一龙公司，丹尼尔·谢弗，斯蒂芬·A·朱迪斯。本申请的申请日为2013年04月09日，优先权日为2012年04月09日，公开日为 2015年06月03日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年09月05日发出驳回决定，以权利要求1-6不具备创造性为由驳回了本申请，其理由是：权利要求1请求保护量化切口和延伸扩增反应中特异性产物的方法。对比文件2（US2009/0081670A1，公开日2009年03月26日,参见对比文件2的摘要，说明书第0014-0034、0145段，图1）公开了一种通过切口和延伸反应扩增靶核苷酸的方法。权利要求1与对比文件2的区别在于：①权利要求1限定引物的修饰方式定位在与靶核酸分子互补序列的3’端的一个或更多个2’修饰的核苷酸；②权利要求1限定在扩增体系中加入可检测的多核苷酸探针，以及相应的步骤(c)。对于区别①，对比文件3（EP1201768A2，公开日2002年05月02日,参见对比文件3摘要，说明书第0012-0018、0046-0047、0024、0032-0040段，实施例3）公开了一种扩增核酸的方法，例如PCR，引物通过与靶核酸互补序列3’端的核苷酸进行2’修饰，可以降低非特异性扩增（如引物二聚体）。对于区别②，对比文件2（参见0033-0034段）公开了使用捕获探针检测扩增产物的方法，在扩增体系中加入可检测的多核苷酸探针是显而易见的。另外，对比文件1（CN1633505A，公开日2005年6月29日）也公开了在基本上等温条件下扩增靶核酸分子的ICAN方法中，可以直接在反应混合物中加入检测探针，以实现扩增产物的检测目的。因此，基于对比文件2、3、1以及本领域常规技术，权利要求1是显而易见的，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。从属权利要求2-5进一步限定了引物修饰的方法，其附加技术特征已被上述对比文件公开或属于本领域的常规选择，因此，从属权利要求2-5也不具备创造性。基于相同或相似的理由，权利要求6也不具备创造性。
驳回决定所依据的文本为进入中国国家阶段时提交的国际申请文件中文文本中的说明书第1-146段(第1-36页)、说明书附图图1-10、说明书摘要以及2016年03月07日提交的权利要求第1-6项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 量化切口和延伸扩增反应中特异性产物的方法，所述方法包括：
(a)在基本上等温条件下，使靶核酸分子与以下接触：聚合酶、两种或更多种引物寡核苷酸、切口酶、以及可检测的多核苷酸探针，所述两种或更多种引物寡核苷酸中的每一个特异性结合所述靶核酸分子上的互补序列，所述切口酶结合双链DNA中的识别序列并且切割所述双链DNA中的一条链，其中每个引物寡核苷酸包含定位在与所述靶核酸分子互补的序列的3’端的一个或更多个2’修饰的核苷酸；
(b)产生包含至少一部分所述靶核酸分子的多个扩增子；并且
(c)检测特异性针对与所述靶核酸分子或其扩增子杂交的寡核苷酸探针的信号，其中所述信号表明在所述样品中存在的所述靶核酸分子或其扩增子的量。
2. 权利要求1所述的方法，其中定位在与所述靶核酸分子互补的序列的5’末端的一个或更多个2’修饰的核苷酸与切口位点隔开1、2、3、4、5或更多个未修饰的核苷酸。
3. 权利要求1所述的方法，其中两个或更多个2’修饰的核苷酸是连续的。
4. 权利要求1所述的方法，其中5个连续的2’-O-甲基修饰的核苷酸定位在与所述靶核酸分子互补的序列的3’端。
5. 权利要求1所述的方法，其中5个连续的2’-O-甲基修饰的核苷酸定位在与所述靶核酸分子互补的序列的5’端。
6. 量化切口和延伸扩增反应中特异性产物的方法，所述方法包括：
(a)在基本上等温条件下，使靶核酸分子与以下接触：聚合酶、两种引物寡核苷酸、切口酶、以及可检测的多核苷酸探针，这两种引物寡核苷酸中的每一个特异性结合所述靶核酸分子上的互补序列，所述切口酶结合双链DNA中的识别序列并且切割所述双链DNA中的一条链，其中每个引物寡核苷酸包含定位在与所述靶核酸分子互补的序列的3’端的5个连续的2’-O-甲基修饰的核苷酸；
(b)产生包含至少一部分所述靶核酸分子的多个扩增子；并且
(c)检测特异性针对与所述靶核酸分子或其扩增子杂交的寡核苷酸探针的信号，其中所述信号表明在所述样品中存在的所述靶核酸分子或其扩增子的量。”
申请人（下称复审请求人）对上述驳回决定不服,于2017年12月20日向国家知识产权局提出了复审请求，未修改申请文件。
复审请求人认为：1）对比文件3是基于传统的热循环依赖性核酸扩增技术的PCR反应，其中完全没有提及本申请和对比文件2中的核酸等温扩增技术，本领域技术人员在面对对比文件3时，仅会得到该技术特征在传统PCR反应中具有降低非特异性扩增的作用的启示，并不能够得出其是否能够在其他类型的核酸扩增反应中起到同样的作用。而对比文件2的等温核酸扩增和对比文件3的热循环依赖性核酸扩增技术原理存在明显区别，基于两篇对比文件的完整技术方案，没有动机进行结合，也无法得到这种结合能否成功的合理预期。而且，对比文件3还教导了所述修饰导致使用某些类型的引物和某些DNA聚合酶时靶序列延伸的延迟，因此，本领域技术人员在面对这一具有不确定性的严重缺陷时，更加没有动机将这两种技术方案进行结合，也没有其是否能够成功的合理预期。2）本申请的技术方案实现了大幅降低背景信号的预料不到的技术效果，即使结合对比文件2和对比文件3，也不可能预见到在靶核酸不存在的情况下所述修饰能否解决背景产物的问题。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年02月22日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。合议组于2019 年01 月21 日向复审请求人发出复审通知书指出：权利要求1与对比文件2的区别在于：1）权利要求1限定了引物的修饰方式为定位在与靶核酸分子互补序列的3’端的一个或更多个2’修饰的核苷酸，而对比文件2并未提及这一点；2）权利要求1限定在扩增体系中加入可检测的多核苷酸探针并实施相应的步骤(c)，而对比文件2中仅提及对扩增产物进行检测的步骤和多种可以采用的检测技术，并未直接公开在扩增过程中添加多核苷酸探针以进行后续检测的具体技术步骤。对于区别1），对比文件3公开了一种可用于核酸序列扩增的修饰的引物，所述修饰的引物在与靶核酸互补序列3’端包含2’修饰的核苷酸，具体可以是2’-O-甲基核苷酸、2’-氨基核苷酸、2’-F-核苷酸,所述修饰的引物可以降低非特异性扩增（参见对比文件3摘要，说明书第0012-0018、0024、0032-0040、0046-0047段，实施例3）。由此可见，对比文件3公开了上述的区别1）。对于区别2），对比文件2公开了可以使用分子信标、捕获探针检测扩增产物的内容（参见0033-0034段）。虽然对比文件2没有明确公开探针是直接加入在扩增体系中的，但本领域技术人员熟知，通过在扩增反应体系中直接加入探针以通过对探针的检测来实时反应检测结果，是本领域的常规技术。因此，综上所述，权利要求1相对于对比文件2、3和本领域常规技术手段的结合是显而易见的，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。从属权利要求2-5进一步限定了引物修饰的方法。对比文件3已经公开了引物修饰可以是对3’端的3个核苷酸的至少一个进行的2’-O-甲基修饰，实施例中具体公开了3’末端进行一个核苷酸修饰和两个核苷酸修饰的技术方案（参见摘要，说明书第0012-0018、0024、0032-0040、0046-0047段，实施例3）。在此基础上，本领域技术人员通过常规调整即容易想到采用从属权利要求2-5限定的具体方式来对引物进行具体修饰，修饰位置和个数是通过常规技术手段可确定的。因此，从属权利要求2-5也不具备创造性。权利要求6请求保护量化切口和延伸扩增反应中特异性产物的方法。基于与上述权利要求4相似的理由，权利要求6也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
复审请求人于2019 年05 月05 日提交了意见陈述书和修改后的权利要求书（共2页6项），对权利要求1和6进行了修改。修改后的权利要求1和6如下：
“1. 量化切口和延伸扩增反应中特异性产物的方法，所述方法包括：
(a)在基本上等温条件下，使靶核酸分子与以下接触：聚合酶、两种或更多种引物寡核苷酸、切口酶、以及可检测的多核苷酸探针，所述切口酶结合双链DNA中的识别序列并且切割所述双链DNA中的一条链，其中每个引物寡核苷酸从5’至3’包含：(i)切口酶识别序列；(ii)与所述靶核酸分子互补的序列；以及(iii)定位在与所述靶核酸分子互补的序列的3’端的一个或更多个2’修饰的核苷酸，其中所述2’修饰选自：2’-O-甲基、2’-甲氧基乙氧基、2’-氟代、2’-羟基、2’-烯丙基、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基]、4’-巯基、4’-CH2-O-2’-桥、4’-(CH2)2-O-2’-桥、2’-LNA、以及2’-O-(N-氨基甲酸甲酯)或包含碱基类似物的那些；
(b)产生包含至少一部分所述靶核酸分子的多个扩增子；并且
(c)检测特异性针对与所述靶核酸分子或其扩增子杂交的寡核苷酸探针的信号，其中所述信号表明在所述样品中存在的所述靶核酸分子或其扩增子的量。”
“6. 量化切口和延伸扩增反应中特异性产物的方法，所述方法包括：
(a)在基本上等温条件下，使靶核酸分子与以下接触：聚合酶、两种引物寡核苷酸、切口酶、以及可检测的多核苷酸探针，所述切口酶结合双链DNA中的识别序列并且切割所述双链DNA中的一条链，其中每个引物寡核苷酸从5’至3’包含：(i)切口酶识别序列；(ii)与所述靶核酸分子互补的序列；以及(iii)定位在与所述靶核酸分子互补的序列的3’端的5个连续的2’-O-甲基修饰的核苷酸；
(b)产生包含至少一部分所述靶核酸分子的多个扩增子；并且
(c)检测特异性针对与所述靶核酸分子或其扩增子杂交的寡核苷酸探针的信号，其中所述信号表明在所述样品中存在的所述靶核酸分子或其扩增子的量。”
结合上述修改后的权利要求书，复审请求人认为：1）对比文件2未公开有关修饰的核苷酸的技术特征；对比文件3仅仅教导了在普通的PCR反应中测试其引物，从未公开或教导其中在3’端具有2’修饰的引物能够用于等温DNA扩增反应，而普通的PCR反应中的引物结构与等温DNA扩增的引物结构是截然不同的，引物结构直接影响引物实现的功能和效果。对比文件3既没有教导在切口酶的存在下进行扩增，也没有教导引物中包含切口酶识别序列，本领域技术人员没有动机将对比文件3的技术特征与对比文件2的技术方案结合。此外，对比文件3仅教导了至多3个核苷酸被修饰，未教导5个连续核苷酸的修饰，因此即便尝试将对比文件2和3结合，也无法得到权利要求6的技术方案；2）本申请的技术方案专用于等温扩增技术，所采用的酶是专用于等温扩增反应的酶，而现有技术已经明确教导在该技术中不适合在距离引物3’末端6个核苷酸以内进行修饰，本申请产生的有利效果是无法预期的。
复审请求人于2019 年08 月16日再次提交了意见陈述书和修改后的权利要求书（共1页4项），修改后的权利要求书如下：
“1．量化切口和延伸扩增反应中特异性产物的方法，所述方法包括：
（a）在基本上等温条件下，使靶核酸分子与以下接触：聚合酶、两种或更多种引物寡核苷酸、切口酶、以及可检测的多核苷酸探针，所述切口酶结合双链DNA中的识别序列并且切割所述双链DNA中的一条链，其中至少一种引物寡核苷酸从5’至3’包含：（i）切口酶识别序列；（ii）与所述靶核酸分子互补的序列；以及（ii1）定位在与所述靶核酸分子互补的序列的3’端的5个连续的2’一0一甲基修饰的核苷酸；
（b）产生包含至少一部分所述靶核酸分子的多个扩增子；并且
（c）检测特异性针对与所述靶核酸分子或其扩增子杂交的寡核苷酸探针的信号，其中所述信号表明在所述样品中存在的所述靶核酸分子或其扩增子的量。
2．权利要求1所述的方法，其中至少一种引物寡核苷酸从5’至3’包含：（i）切口酶识别序列；（ii）与所述靶核酸分子互补的序列；以及（ii1）定位在与所述靶核酸分子互补的序列的5’端的一个或更多个2’修饰的核苷酸，并且其与切口位点隔开1、2、3、4、5或更多个未修饰的核苷酸。
3．权利要求2所述的方法，其中两个或更多个连续的2’修饰的核苷酸定位在与所述靶核酸分子互补的序列的5’端。
4．量化切口和延伸扩增反应中特异性产物的方法，所述方法包括：
（a）在基本上等温条件下，使靶核酸分子与以下接触：聚合酶、两种或更多种引物寡核苷酸、切口酶、以及可检测的多核苷酸探针，所述切口酶结合双链DNA中的识别序列并且切割所述双链DNA中的一条链，其中至少一种引物寡核苷酸从5’至3’包含：（i）切口酶识别序列；（ii）与所述靶核酸分子互补的序列；以及（ii1）定位在与所述靶核酸分子互补的序列的5’端的5个连续的2’-0-甲基修饰的核苷酸；
（b）产生包含至少一部分所述靶核酸分子的多个扩增子；并且
（c）检测特异性针对与所述靶核酸分子或其扩增子杂交的寡核苷酸探针的信号，其中所述信号表明在所述样品中存在的所述靶核酸分子或其扩增子的量。”
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
经审查，复审请求人于2019年08月16日提交的权利要求书（共4项）符合专利法第33条和专利法实施细则第61条第1款的规定，因此，本复审决定所针对的文本为本申请进入中国国家阶段时复审请求人提交的国际申请文件中文文本中的说明书第1-146段(第1-36页)、说明书附图图1-10、说明书摘要以及2019年08月16日提交的权利要求第1-4项。
关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
如果权利要求所要求保护的技术方案与最接近的现有技术的区别特征是相同领域其它对比文件中披露的相关的技术手段，该技术手段在该对比文件中所起的作用与该区别特征在要求保护的发明中为解决发明实际解决的技术问题所起的作用相同，则认为现有技术整体上存在改进最接近的现有技术而获得所要求保护的技术方案的启示，此时该权利要求相对于现有技术是显而易见的，不具备创造性，反之则具备创造性。
本案中，权利要求1请求保护量化切口和延伸扩增反应中特异性产物的方法，所述方法包括等温扩增、产生多个扩增子以及利用寡核苷酸探针进行检测的步骤，其中具体限定了等温扩增中所使用的至少一种引物寡核苷酸从5’至3’包含：（i）切口酶识别序列；（ii）与所述靶核酸分子互补的序列；以及（ii1）定位在与所述靶核酸分子互补的序列的3’端的5个连续的2’-O-甲基修饰的核苷酸。
对比文件2公开了一种通过切口和延伸反应快速扩增靶核苷酸的方法,所述方法具体包括：在等温条件下，使靶核酸（如DNA）与两种模板寡核酸（即引物）、聚合酶、切口酶接触，模板寡核酸特异性结合靶核酸上的互补序列，切口酶（如Nt.BspQI、Nt.AlwI等）切割双链的一个链；产生扩增产物（即包含至少一部分所述靶核酸分子的多个扩增子）；检测扩增产物，其中罗列了多种检测扩增产物的方法，包括凝胶电泳、荧光检测、分子信标、FRET、质谱、捕获探针等多种方法；所述模板寡核酸包括位于3’端的靶序列互补区、互补区上游的切口酶识别序列以及识别序列上游的稳定区域（参见对比文件2摘要，说明书第0014-0034、0158-0174段、图1）。
权利要求1与对比文件2的区别技术特征在于：1）至少一种引物寡核苷酸包含定位在与所述靶核酸分子互补的序列的3’端的5个连续的2’-0-甲基修饰的核苷酸，而对比文件2中并未提及模板寡核酸包含修饰的核苷酸这一点；2）权利要求1限定在扩增体系中加入可检测的多核苷酸探针并实施相应的步骤(c)，而对比文件2中仅提及对扩增产物进行检测的步骤和多种可以采用的检测技术，并未直接公开在扩增过程中就添加多核苷酸探针以进行后续检测的具体技术步骤。本申请说明书记载，2’修饰的引物-模板寡核苷酸能够在不防止修饰的引物-模板扩增的情况下减少或消除不合理的扩增，以扩增特异性产物，说明书中的实施例也证实了包含2’-O-甲基核苷酸的引物-模板寡核苷酸减少或消除了等温扩增中的背景信号（参见本申请说明书第17页倒数第1段和实施例）。因此，基于上述区别特征可以确定，本申请实际解决的技术问题是提高等温扩增反应的扩增特异性，降低背景信号,以准确检测扩增产物。
对比文件3公开了一种可用于核酸序列扩增的修饰的引物，所述修饰的引物在与靶核酸互补序列3’端包含2’修饰的核苷酸，具体可以是2’-O-甲基核苷酸、2’-氨基核苷酸、2’-F-核苷酸,对比文件3中还记载所述修饰的引物可以降低非特异性扩增。具体实施例中记载了3’末端分别存在1-3个2’-O-甲基核苷酸的技术方案，以及每间隔4个核苷酸存在一个修饰的技术方案。实验结果表明，修饰对于扩增的影响与修饰的核苷酸碱基种类和数量有关，一个C或U或G修饰导致扩增会导致扩增反应延迟0.5个循环，两个C或U或G修饰会导致扩增反应延迟1.8个循环；而A修饰导致扩增反应延迟4-5个循环，两个修饰虽然能有效延迟引物二聚体的形成，但同时靶核酸的扩增也出现了最大的延迟，因此不优选存在两个修饰的方案，但在有些反应条件下，两个修饰的方案也是有用的。在采用3’末端存在3个修饰核苷酸来扩增病毒的实验中，扩增反应延迟了3.2个循环（参见对比文件3摘要，说明书第0012-0018、0024、0032-0040、0046-0047段，实施例3，5,6,7）。由此可见，对比文件3虽然提及了修饰引物3’末端核苷酸可以减少或抑制核酸扩增反应中的非特异性扩增，降低背景信号，但对比文件3中只公开了3’末端分别存在1-3个连续修饰核苷酸或从3’末端开始存在多个散在分布的不连续修饰核苷酸的方案，其中并未公开3’末端存在5个连续修饰核苷酸的技术方案,即对比文件3并未公开上述的区别技术特征1）。而且，基于对比文件3中所给出的末端修饰核苷酸的数目增多很可能会导致扩增延迟的教导，本领域技术人员通常不会想到进一步增加末端修饰的连续核苷酸的数目，因为数目的进一步增加很可能会导致扩增反应的进一步延迟，不利于扩增反应的顺利进行，即对比文件3虽然给出了通过对引物3’端进行1-3个连续修饰核苷酸以降低核酸扩增反应中非特异性扩增的明确教导和启示，但同时也给出了末端修饰核苷酸个数增加很可能会导致扩增反应进一步延迟的教导，因此，基于对比文件3的整体教导，本领域技术人员通常不会产生将引物3’端的修饰直接调整为5个连续核苷酸修饰并将其进一步用于等温扩增反应的动机。同样，对比文件1也未公开该区别技术特征或给出相应的技术启示。因此，虽然上述区别技术特征2）是本领域的常规技术手段，但在对比文件2、3、1均未公开上述区别技术特征1），也未给出相应技术启示的基础上，难以得出上述修改后的权利要求1的技术方案，权利要求1相对于对比文件2、3或2、3、1的结合并非显而易见。
从属权利要求2-3进一步限定了引物所包含的序列和修饰的位置。基于相同的理由，在难以得出权利要求1不具备创造性的结论的基础上，同样不能得出从属权利要求2、3不具备创造性的结论。
权利要求4请求保护与权利要求1类似的方案，两者差异仅在于权利要求4限定所述修饰存在于引物中靶核酸分子互补序列的5’末端，而权利要求1限定修饰存在于引物中靶核酸分子互补序列的3’末端。而如上所述，对比文件2、3、1均未公开在引物中进行5个连续核苷酸修饰的方案，也未给出相应的技术启示，同时本领域技术人员在对比文件2、3、1的基础上也难以想到在引物所包含的靶核酸分子互补序列的5’末端，即引物的某个中间位置，而非末端进行连续5个核苷酸的修饰。综上，基于与权利要求1相似的理由，同样也不能得出修改后的权利要求4不具备专利法第22条第3款规定创造性的结论。
基于以上事实和理由，本案合议组作出如下审查决定。
三、决定
撤销国家知识产权局于2017 年09 月05 日对本申请作出的驳回决定。由国家知识产权局原审查部门在本决定所针对文本的基础上对本申请继续进行审查。
如对本复审请求审查决定不服,根据专利法第41条第2款的规定,请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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