发明创造名称：一种淡水水体中D型氨基酸的提取与测定方法
外观设计名称：
决定号：188620
决定日：2019-08-27
委内编号：1F259846
优先权日：
申请（专利）号：201710614278.1
申请日：2017-07-25
复审请求人：中国环境科学研究院
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：淡美俊
合议组组长：周永恒
参审员：徐恩波
国际分类号：G01N30/89，G01N30/06，G01N30/14，G01N30/74，G01N30/34
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果一项权利要求与作为最接近的现有技术的对比文件相比存在区别特征，而另一份对比文件公开了一部分区别特征并存在与对比文件1相结合的技术启示，其余部分区别特征属于本领域的公知常识，则该项权利要求不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201710614278.1、名称为“一种淡水水体中D型氨基酸的提取与测定方法”的发明专利申请（下称本申请），其申请日为2017年07月25日，公开日为2017年11月24日，申请人为中国环境科学研究院。
经实质审查，国家知识产权局专利实质审查部门以本申请权利要求1-4不具备专利法第22条第3款规定的创造性为由于2018年06月22日驳回了本申请。驳回决定中引用了如下对比文件：
对比文件1：铜绿微囊藻培养过程中氨基酸的释放特征及其对水体有机质的贡献，于茜等，《环境科学研究》，第29卷第3期，第360-367页，公开日为2016年03月31日；
对比文件2：Liquid-chromatograpHic determination fi amino-acid enantiomers by derivatization with O-pHthaldialdehyde and chiral thiols-applications with reference to food-science，H. Bruckner a,et al. ，《Journal of Chromatography A》，第697卷，第229-245页，公开日为1995年04月21日。
驳回决定所针对的文本为：2018年02月27日提交的权利要求第1-4项；申请日2017年07月25日提交的说明书摘要、说明书第1-9页。
驳回决定所针对的权利要求如下：
“1. 一种淡水水体中D型氨基酸的提取和测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.取样
水体样品过0.45μm滤膜去除杂质，-4℃条件下，黑暗密封保存；
S2.水样预处理
采用微波辅助气相酸水解的方法进行：取待测水样，加入抗坏血酸溶液以防止待测溶液中氨基酸发生氧化，加入盐酸溶液，混匀后放入微波消解仪，进行消解得水解液；
所述水样预处理的具体步骤为：取1ml待测水样，加入100-120μl 12mmol L-1抗坏血酸溶液以防止待测溶液中氨基酸发生氧化，加入0.5-0.6ml 6mol L-1盐酸溶液，混匀后转移至消解罐中，将消解罐放入微波消解反应容器中，向微波消解反应容器加入25ml 6mol L-1盐酸溶液后密封，抽真空，充入氮气，进行消解；
所述微波消解仪输出功率为600W，自动升温程序为：2-4min内升温至150℃，150℃保持30-35min，样品冷却至80℃后，程序结束；
将所述水解液冷却至室温后，用碱液中和至中性，得待测样品，密封待测；
S3.衍生剂制备
将N-异丁酰-D-半胱氨酸和邻苯二甲醛溶解到甲醇溶液中，使用缓冲溶液稀释，使得N-异丁酰-D-半胱氨酸的浓度为5-6g/L和邻苯二甲醛的浓度为2-2.5g/L，所得溶液为邻苯二甲醛衍生剂，4℃密封保存；
S4.衍生反应
取待测样品，依次加入邻苯二甲醛衍生剂和缓冲溶液，涡旋器混匀，室温下放置，保证氨基酸与邻苯二甲醛充分发生衍生反应；
S5.仪器测定
采用高效液相色谱-荧光检测器进行测定；采用反相C18高效液相色谱柱对D型和L型氨基酸进行分离；其中，色谱柱为：LiChrospher 100RP-18色谱柱；流动相的组成为：流动相A采用35-45mmol L-1磷酸二氢钾缓冲溶液，pH＝12；流动相B采用甲醇：乙腈＝13:1(体积比)；采用梯度洗脱；
所述高效液相色谱-荧光检测器的分离检测条件为：流动相A采用40mmol L-1磷酸二氢钾缓冲溶液，pH＝12，过0.22μm滤膜；流动相B采用甲醇：乙腈＝13:1(体积比)，过0.22μm滤膜；梯度洗脱程序如下：
流速为0.8ml min-1，柱温30℃，进样量为10-30μl，检测器为荧光检测器，激发波长为350nm，发射波长为420nm。
2. 根据权利要求1所述的一种淡水水体中D型氨基酸的提取和测定方法，其特征在于，所述碱液为NaOH溶液和KOH溶液中的一种或两种的混合。
3. 根据权利要求1所述的一种淡水水体中D型氨基酸的提取和测定方法，其特征在于，所述衍生剂制备的具体过程为：将0.05-0.06g N-异丁酰-D-半胱氨酸和0.02-0.03g邻苯二甲醛溶解到1ml甲醇溶液中，使用pH值为9.5，浓度为0.5mol L-1硼酸缓冲溶液稀释至10ml，所得溶液为邻苯二甲醛衍生剂。
4. 根据权利要求1所述的一种淡水水体中D型氨基酸的提取和测定方法，其特征在于，所述衍生反应为：取待测样品，依次加入邻苯二甲醛衍生剂和pH值为9.5，浓度为0.5mol L-1硼酸缓冲溶液，涡旋器混匀，室温下放置20-30min，保证氨基酸与邻苯二甲醛充分发生衍生反应；其中，待测样品、邻苯二甲醛衍生剂和pH值为9.5，浓度为0.5mol L-1硼酸缓冲溶液的体积比为：1：(1-1.2)：(1-1.2)。”
驳回决定的具体理由是：1、权利要求1与对比文件1的区别在于：（1）对比文件1中仅说明了用邻苯二甲醛（OPA）柱前衍生，而没有具体公开衍生剂的制备方法和具体的衍生反应步骤。而权利要求1中衍生剂制备为将N-异丁酰-D-半胱氨酸和邻苯二甲醛溶解到甲醇溶液中，使用缓冲溶液稀释，使得N-异丁酰-D-半胱氨酸的浓度为5-6g/L和邻苯二甲醛的浓度2-2.5g/L，所得溶液为邻苯二甲醛衍生剂，4℃密封保存；以及限定了具体的衍生反应步骤；（2）对比文件1中的样品为将太湖水样经后续藻类培养后的培养液，并采用在恒温箱中水解的方式进行预处理；而本申请中的样品为水体样品过0.45μm滤膜去除杂质，在-4℃下，黑暗密封保存的样品；并采用微波辅助气相酸水解的方式进行水样预处理，同时限定了具体的预处理步骤；（3）流动相的pH值、梯度洗脱程序以及其他色谱条件不同。区别技术特征（1）是本领域在对比文件2的基础上结合本领域的常规实验手段可以确定的，区别技术特征（2）是本领域的常规技术手段，区别技术特征（3）是本领域的常规技术手段，因此，权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。2、从属权利要求2的附加技术特征部分被对比文件1公开，部分是本领域的公知常识，从属权利要求3-4的附加技术特征是本领域的公知常识，因此，在其引用的权利要求不具备创造性的情况下，从属权利要求2-4不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
申请人中国环境科学研究院（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年08月31日向国家知识产权局提出了复审请求，同时提交了权利要求书的全文修改替换页，修改具体涉及：将从属权利要求3-4的附加技术特征加入到权利要求1中，删除权利要求3-4。复审请求人认为：（1）本发明与D1解决的技术问题不同，采用的水解手段不同，同时本发明采用的微波辅助气相酸水解并非本领域的常规技术手段，该方法大大缩短了分析时间，保证了自然水体中低浓度氨基酸能被仪器检出，提高了检测效率和检测结果的准确性。（2）D2是采用液相色谱技术分离并测定食物和饮料中的D一型氨基酸。食物和饮料中D型氨基酸含量均很高，远远高于本发明太湖水体中D型氨基酸的含量。因此，本发明与D2解决的技术问题不同，食物饮料中的D型氨基酸方法不能应用于实际水体样品的测定。（3）对比文件1无法检测出本发明的低浓度值的各氨基酸；同时，本发明的各氨基酸的检测限要远低于对比文件1的检测限。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年10月09日依法受理了该复审请求，并将其转送至原专利实质审查部门进行前置审查。
原专利实质审查部门在前置审查意见书中坚持驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年07月05日向复审请求人发出复审通知书，指出：1、权利要求1与对比文件1的区别在于：（1）对比文件1中仅说明了用邻苯二甲醛（OPA）柱前衍生，而没有具体公开衍生剂的制备方法和具体的衍生反应步骤；（2）对比文件1采用在恒温箱中水解的方式进行预处理；而本申请中的水体样品过0.45μm滤膜去除杂质，在-4℃下，黑暗密封保存；并采用微波辅助气相酸水解的方式进行水样预处理，同时限定了具体的预处理步骤；（3）流动相的pH值、梯度洗脱程序以及其他色谱条件不同。区别技术特征（1）是本领域在对比文件2的基础结合本领域的常规实验手段可以确定，区别技术特征（2）是本领域的常规技术手段，区别技术特征（3）是本领域的常规技术手段，因此，权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。2、从属权利要求2的附加技术特征或被对比文件1公开，或属于本领域常用技术手段，因此，从属权利要求2不具备专利法第22条第3款规定的创造性。3、合议组针对复审请求人陈述的权利要求具备创造性的理由进行了回应。
复审请求人于2019年07月30日提交了意见陈述书，没有修改申请文件。复审请求人陈述了权利要求具备创造性的理由。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
本审查决定针对的权利要求如下：
“1. 一种淡水水体中D型氨基酸的提取和测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.取样
水体样品过0.45μm滤膜去除杂质，-4℃条件下，黑暗密封保存；
S2.水样预处理
采用微波辅助气相酸水解的方法进行：取待测水样，加入抗坏血酸溶液以防止待测溶液中氨基酸发生氧化，加入盐酸溶液，混匀后放入微波消解仪，进行消解得水解液；
所述水样预处理的具体步骤为：取1ml待测水样，加入100-120μl 12mmol L-1抗坏血酸溶液以防止待测溶液中氨基酸发生氧化，加入0.5-0.6ml 6mol L-1盐酸溶液，混匀后转移至消解罐中，将消解罐放入微波消解反应容器中，向微波消解反应容器加入25ml 6mol L-1盐酸溶液后密封，抽真空，充入氮气，进行消解；
所述微波消解仪输出功率为600W，自动升温程序为：2-4min内升温至150℃，150℃保持30-35min，样品冷却至80℃后，程序结束；
将所述水解液冷却至室温后，用碱液中和至中性，得待测样品，密封待测；
S3.衍生剂制备
将N-异丁酰-D-半胱氨酸和邻苯二甲醛溶解到甲醇溶液中，使用缓冲溶液稀释，使得N-异丁酰-D-半胱氨酸的浓度为5-6g L-1和邻苯二甲醛的浓度为2-2.5g L-1，所得溶液为邻苯二甲醛衍生剂，4℃密封保存；
所述衍生剂制备的具体过程为：将0.05-0.06g N-异丁酰-D-半胱氨酸和0.02-0.03g邻苯二甲醛溶解到1ml甲醇溶液中，使用pH值为9.5，浓度为0.5mol L-1硼酸缓冲溶液稀释至10ml，所得溶液为邻苯二甲醛衍生剂；
S4.衍生反应
所述衍生反应为：取待测样品，依次加入邻苯二甲醛衍生剂和pH值为9.5，浓度为0.5mol L-1硼酸缓冲溶液，涡旋器混匀，室温下放置20-30min，保证氨基酸与邻苯二甲醛充分发生衍生反应；其中，待测样品、邻苯二甲醛衍生剂和pH值为9.5，浓度为0.5mol L-1硼酸缓冲溶液的体积比为1∶(1-1.2)∶(1-1.2)；
S5.仪器测定
采用高效液相色谱-荧光检测器进行测定；采用反相C18高效液相色谱柱对D型和L型氨基酸进行分离；其中，色谱柱为：LiChrospher 100RP-18色谱柱；流动相的组成为：流动相A采用35-45mmol L-1磷酸二氢钾缓冲溶液，pH＝12；流动相B采用甲醇∶乙腈＝13∶1(体积比)；采用梯度洗脱；
所述高效液相色谱-荧光检测器的分离检测条件为：流动相A采用40mmol L-1磷酸二氢钾缓冲溶液，pH＝12，过0.22μm滤膜；流动相B采用甲醇∶乙腈＝13∶1(体积比)，过0.22μm滤膜；梯度洗脱程序如下：
流速为0.8ml min-1，柱温30℃，进样量为10-30μl，检测器为荧光检测器，激发波长为350nm，发射波长为420nm。
2. 根据权利要求1所述的一种淡水水体中D型氨基酸的提取和测定方法，其特征在于，所述碱液为NaOH溶液和KOH溶液中的一种或两种的混合。”
二、决定的理由
（一）、审查文本的认定
本复审请求审查决定所针对的文本为：2018年08月31日提交的权利要求第1-2项；申请日2017年07月25日提交的说明书摘要、说明书第1-9页。
（二）、关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。
如果一项权利要求与作为最接近的现有技术的对比文件相比存在区别特征，而另一份对比文件公开了一部分区别特征并存在与对比文件1相结合的技术启示，其余部分区别特征属于本领域的公知常识，则该项权利要求不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备创造性。
1、对于独立权利要求1，权利要求1要求保护一种淡水水体中D型氨基酸的提取和测定方法，对比文件1公开了一种淡水水体中D型氨基酸的提取和测定方法，并具体公开了以下内容（参见材料与方法部分第1.4节）：
量取150ml培养液（对应于水体）置于烧杯中，在鼓风干燥箱内以60℃烘干（需72h）；烘干后向烧杯中加入5ml 6mol/L的HCl和100μL12mmol/L的抗坏血酸水溶液（即取待测水样，加入抗坏血酸溶液以防止待测溶液中氨基酸氧化，加入盐酸溶液的步骤），充N2 5min，移入110摄氏度恒温箱中水解22h（即得到水解液的步骤）；冷却后取1ml上清液，用6mol/L NaOH水溶液中和（即用碱液中和至中性的步骤），过0.45μm滤膜（即去除杂质的步骤），处理后的样品溶液保存待用（以上为取样和水样预处理的步骤）；
采用邻苯二甲醛（OPA）柱前衍生（即衍生反应的步骤）；
反相高效液相色谱采用外标法进行定量分析；另外，c（D-氨基酸）、c（L-氨基酸）同样采用邻苯二甲醛（OPA）柱前衍生（即衍生反应），反相高效液相色谱法，使用高效液相色谱仪配备荧光检测器（即采用高效液相色谱-荧光检测器进行测定的步骤），色谱分析条件：LiChrospHerl00RP-18色谱柱（即反相C18高效液相色谱柱）：流动相A，V（甲醇）：V（乙腈）为13：1，摇匀后过0.45μm滤膜；流动相B，40mmol/L的KH2PO4水溶液（pH为6.2）；流速1.0mL/min；激发波长为340nm，检测波长为450nm；进样量10μL；梯度洗脱程序：0、12、20、22、31、35、40、50、52、60min时，流动相A占总流动相体积（流动相A和B的混合液体）的比例为90%、72%、70%、65%、63%、53%、45%、35%、90%、90%。
权利要求1与对比文件1的区别在于：（1）对比文件1中仅说明了用邻苯二甲醛（OPA）柱前衍生，而没有具体公开衍生剂的制备方法和具体的衍生反应步骤；（2）对比文件1采用在恒温箱中水解的方式进行预处理；而本申请中的水体样品过0.45μm滤膜去除杂质，在-4℃下，黑暗密封保存；并采用微波辅助气相酸水解的方式进行水样预处理，同时限定了具体的预处理步骤；（3）流动相的pH值、梯度洗脱程序以及其他色谱条件不同。基于上述区别技术特征，可以确定本申请实际解决的技术问题是：（1）如何对衍生化试剂进行制备，优化衍生化反应的条件以使得样品和衍生剂充分发生衍生反应；（2）以及如何对其他样品进行保存及快速高效预处理；（3）如何优化色谱检测条件。
对于区别技术特征（1），对比文件2实验部分第2.1-2.3节公开了以下内容： HPLC-FLD色谱分离D-氨基酸和L-氨基酸时，将N-异丁酰-D-半胱氨酸（IBDC）和邻苯二甲醛（OPA）溶解到甲醇溶液中，使用缓冲溶液稀释，使得N-异丁酰-D-半胱氨酸的浓度为260mM和邻苯二甲醛的浓度为170mM，得邻苯二甲醛衍生剂，对D型和L型氨基酸进行衍生反应以便色谱分离检测，且其在对比文件2中所起的作用与其在本申请中所起的作用相同，均是用于D型氨基酸的手性衍生化以便D型氨基酸的手性分离，即对比文件2给出了采用上述方法手性衍生D型和L型氨基酸的启示，本领域技术人员在对比文件2的启示下完全可以将上述制备衍生剂的方法应用于对比文件1中以手性衍生D型和L型氨基酸以便色谱分离检测。邻苯二甲醛与氨基酸的衍生反应属于公知的化学反应，需在碱性条件下进行，缓冲溶液的浓度及PH值、各种试剂（N-异丁酰-D-半胱氨酸（IBDC）、邻苯二甲醛（OPA））和样品的用量（包括浓度和体积比）、衍生反应的时间与衍生反应效果密切相关，通过有限的常规实验对衍生反应过程中的各种参数（如缓冲溶液的PH值和浓度、反应时间、试剂用量）进行优化以使得样品和衍生剂充分发生衍生反应属于本领域技术人员所必备的基本实验技能；
对于区别技术特征（2），将水体样品经滤膜去除杂质以避免杂质干扰，并在水样取样后在低温下，如-4℃下黑暗密封保存以有利于水体中D型氨基酸的保存及后续的有效检出及提取均是本领域的常规技术手段，本领域技术人员完全可以根据实际需求进行选择。对比文件1中使用了在恒温箱中水解的方式进行酸水解，但用微波辅助水解的方式进行水样预处理从而实现快速高效预处理，提高分析准确性是本领域的常规技术手段，其具体操作步骤属于本领域的常规手段，微波辅助酸水解过程中，微波功率、水解温度和时间会对这些参数直接影响着水解的程度和效果，通过有限的常规实验对衍生反应过程中的各种参数（如缓冲溶液的PH值和浓度、反应时间、试剂用量）进行优化以使得水解更加彻底属于本领域技术人员所必备的基本实验技能。
对于区别技术特征（3），本领域技术人员完全可以通过合乎逻辑的分析、推理和有限的试验并借助常规试验手段确定色谱条件和参数，比如流动相的pH值、梯度洗脱程序、流速、柱温、进样量、检测器激发波长和发射波长等，并且这样得到的技术方案所产生的效果也是本领域技术人员可以合理预期的。
综上所述，在对比文件1的基础上结合对比文件2及本领域的常规技术手段得到权利要求1要求保护的技术方案对于本领域技术人员是显而易见的，权利要求1不具备突出地实质性特点与显著地进步，因而不具备创造性。
2、权利要求2不符合专利法第22条第3款的规定。
从属权利要求2对碱液进行了进一步限定，对比文件1公开了碱液为氢氧化钠水溶液（参见对比文件1第362页第1.4节），因此在其引用的权利要求不具备创造性的基础上，权利要求2碱液为氢氧化钠溶液的技术方案也不具备创造性。
对于权利要求2中碱液为氢氧化钾溶液或其与氢氧化钠溶液的混合的技术方案，氢氧化钠和氢氧化钾属于常规碱性溶液，用氢氧化钾溶液或其与氢氧化钠溶液的混合代替氢氧化钠属于常规手段的替换，并且其技术效果也都是可以预期的。因此在其引用的权利要求不具备创造性的基础上，权利要求2的这些并列技术方案也不具备创造性。
（三）.针对复审请求人提出的陈述意见的答复：
复审请求人认为：(1)、本申请的核心是各个步骤中的参数以及步骤的改变，D2公开了260mM N-异丁酰-D-半胱氨酸和170mM邻苯二甲醛作为衍生剂，没有公开衍生化制备以及反应过程（包括衍生试剂的质量以及溶剂、缓冲溶液的种类、PH值和加入量、衍生反应温度和时间），与本申请处理对象不同，不会想到对比文件1中邻苯二甲醛柱前衍生就是对比文件2中的衍生剂。参数选取是经过大量实验研究及分析测定D型氨基酸结果的准确性做出的最优结果，在只给出原料，未给出参数和步骤的基础上，选择范围是无限的，不是常规选择。衍生反应受水体样品与衍生剂的配比和衍生剂浓度影响较大，本申请通过控制衍生剂的量和浓度，保证了D型氨基酸与衍生剂充分发生衍生反应，进一步有利于结果的准确测定。
(2)、现有技术中没有公开微波消解反应容器进行消解反应，其也不是常规技术手段。本申请采用气相酸水解，水体样品经消解后仅稀释了10倍，充分保证氨基酸能够被仪器检出。另外，由于淡水里的D型氨基酸的含量与干扰成分的复杂性，酸量加大可以使水体中的D型氨基酸充分水解，水解更彻底，测量结果准确。本申请采用微波辅助气相酸水解的前处理方法，实现了对淡水水体中D型氨基酸的提取与测定，具有操作简便、回收率高、方法精密度高等优点。微波辅助气相酸水解的方法大大缩短了分析时间，提高了检测效率。
(3)、本申请提供的滤膜直径、色谱条件中梯度洗脱程序、流速、波长和PH值和对比文件不同。对比文件1没有提及方法精密度和回收率，对比文件1表3中D型氨基酸的含量范围为0.8-5.5 umolL-1显著高于本申请表1D型氨基酸含量0.09-0.19 umolL-1， 对比文件1无法检测出本申请的低浓度值的各氨基酸。本申请仪器测定时的洗脱时间长，洗脱程序精细，经仪器分离出的4种D型氨基酸峰型对称，没有出现拖尾峰和分叉峰，且各物质峰之间相不干扰，分离效果较好。
合议组经查认为：
（1）、首先，对于衍生化反应来说，对比文件2的检测对象是D-型氨基酸，食物和饮料的样品基质以及D型氨基酸含量的高低并不影响其给出使用N-异丁酰-D-半胱氨酸（IBDC）和邻苯二甲醛（OPA）制备邻苯二甲醛衍生剂用于手性衍生D型和L型氨基酸以便色谱分离的启示，对比文件1已经给出了邻苯二甲醛进行柱前衍生，在此基础上，本领域技术人员有动机选择任何一种邻苯二甲醛柱前衍生的方法，包括对比文件2中使用的衍生方法，对比文件1给出了与对比文件2结合的技术启示。
其次，对比文件2虽然没有公开衍生化制备以及反应过程，但是对于一种公知的衍生化反应的参数进行优化选择，使得衍生反应充分，进一步有利于结果的准确测定，是化学分析领域普通技术人员所必备的基本专业技能。具体来说，使用N-异丁酰-D-半胱氨酸（IBDC）和邻苯二甲醛（OPA）用于手性衍生D型和L型氨基酸也是一种公知的衍生化手段，其需要在碱性条件下进行，通常选用甲醇和硼砂缓冲液（即硼酸缓冲液）作为氨基酸的衍生反应介质，其衍生反应式为:
本领域技术人员都知晓缓冲液的浓度、PH值、缓冲溶液和衍生试剂和样品的用量比（可以分为浓度和体积比）与衍生反应程度和效率密切相关，会衍生反应效率产生影响，缓冲液的PH值选择范围通常在8.5-11之间、浓度可以根据需求选择，根据衍生反应的化学反应式进行参数选择，并不是在无限的范围内进行选择，而且可以通过有限的正交优化实验确定各种试剂的浓度和体积比以保证衍生反应充分进行，属于本领域技术人员所必备的基本实验技能，即复审请求人强调的“衍生反应受水体样品与衍生剂的配比和衍生剂浓度影响较大，本申请通过控制衍生剂的量和浓度，保证了D型氨基酸与衍生剂充分发生衍生反应，进一步有利于结果的准确测定”属于衍生化反应中的公知常识，是可以预期的技术效果。也就是说，本申请使用N-异丁酰-D-半胱氨酸（IBDC）和邻苯二甲醛（OPA）代替邻苯二甲醛（OPA）已被对比文件2公开了，而上述衍生化制备以及反应过程中的参数选择是本领域技术人员在现有技术的基础上通过有限的实验就能得到的，且参数的选取也没有产生任何预料不到的效果，因此这种改变对于本领域技术人员而言是显而易见的，不具备创造性的进步。
（2）、对于使用微波消解反应容器进行消解反应这种技术手段来说，微波技术是通过微波的快速加热，使样品在高温高压下，表面层搅动、破裂，不断产生新的样品表面与溶剂接触，直至样品消解完毕。商品化的微波水解仪（作为消解反应容器）已经广泛应用于蛋白质的水解，这属于本领域的常规技术手段。
对于微波消解来说，其特点就是大大缩短了分析时间，提高了检测效率（常规水解方法为22-24h，如对比文件1中的水解时间为22h，微波水解时间通常为30min左右），高效节能，分析准确和精密度高，因此复审请求人强调的技术效果“本申请采用气相酸水解，水体样品经消解后仅稀释了10倍，充分保证氨基酸能够被仪器检出”和“本申请采用微波辅助气相酸水解的前处理方法，实现了对淡水水体中D型氨基酸的提取与测定，具有操作简便、回收率高、方法精密度高等优点。微波辅助气相酸水解的方法大大缩短了分析时间，提高了检测效率”是由微波辅助气相酸水解带来的，而由微波辅助气相酸水解的原理和特点可知，上述强调的技术效果是本领域技术人员可以预期的技术效果。对于氨基酸酸水解来说，显然“酸量加大可以使水体中的D型氨基酸充分水解，水解更彻底，测量结果准确”，这也属于本领域技术人员可以预期的技术效果。对于微波辅助酸水解中的参数设定来说，不同的微波水解仪因仪器参数不一，选择的水解条件可能会有所不同，因此可以根据微波水解仪给出参数设定的范围，通过正交优化实验确定最佳的微波辅助酸水解的参数，这属于本领域技术人员在现有技术的基础上通过有限的实验就能得到的，且参数的选取也没有产生任何预料不到的效果。也就是说，本申请使用微波辅助气相酸水解代替传统加热酸水解，并设定具体参数，对于本领域技术人员而言是显而易见的，不具备创造性的进步。
（3）、使用液相色谱分离D型氨基酸的技术也属于十分成熟且应用及其广泛的技术，且对比文件1已经公开了核心的色谱参数（色谱柱和流动相），且本领域技术人员都知晓，对于反相液相色谱的氨基酸分离分析来说，在通常范围内，流动相中有机溶剂的比例越低（升高的越慢、梯度陡度低），越有利分离，分离效果越好，但是分析时间延长，因此在对比文件1的基础上，根据现有技术的常识和实际的分离需求（分离效果和分析时间）设定梯度洗脱程序等参数属于本领域技术人员的常规手段。本申请的流动相B为有机相，在0-50min内，流动相B的比例为0，而对比文件1的有机相流动相B，在0-50min内，流动相B的比例为10%-65%-10%，本申请流动相中的有机溶剂比例在相同的时间内比对比文件1更低，因此本申请的分离效果会更好，但是分析时间更长，根据上述分析可知，“本申请仪器测定时的洗脱时间长，洗脱程序精细，经仪器分离出的4种D型氨基酸峰型对称，没有出现拖尾峰和分叉峰，且各物质峰之间相不干扰，分离效果较好”属于可以预期的技术效果。
检测限是指从样品中测出待测物质能区别于零值的最小浓度，是体现方法和仪器灵敏度的指标。对比文件1表3中是针对经过不同培养时间的培养液检测得到的各氨基酸的含量，表3中的含量数值体现的是待测培养液样品的浓度（其取决于待测培养液的实际浓度），而并非该方法能够检测待测样品的最小浓度。由该表格并不能得出对比文件1的色谱条件对于各氨基酸的检测限。此外，对比文件1表3中的检测结果与本申请实施例对应氨基酸的检测结果（本申请说明书第0069段）也处于同一数量级，他们的差异并不能说明本申请的方法相对于对比文件1的方法能够产生意料不到的技术效果。因此，复审请求人基于该表格中的各氨基酸含量的最低值认为本申请方法的检测限低于对比文件1方法的检测限的理由不成立。
因此，复审请求人的上述关于本申请具备创造性的理由合议组不予支持。
基于以上事实和理由，合议组作出如下决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2018年06月22日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
郑重声明：本文版权归原作者所有，转载文章仅为传播更多信息之目的，如作者信息标记有误，请第一时间联系我们修改或删除，多谢。
