发明创造名称：一种口蹄疫病毒胶体金试纸条、病原快速检测试剂盒及其制备方法
外观设计名称：
决定号：191131
决定日：2019-09-26
委内编号：1F268959
优先权日：
申请（专利）号：201611075628.3
申请日：2016-11-30
复审请求人：江苏博爱生物科技有限公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：石剑平
合议组组长：杨冀川
参审员：王晓媛
国际分类号：G01N33/532,G01N33/543,G01N33/558,G01N33/569,G01N33/577
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果一项权利要求与作为最接近现有技术的对比文件相比存在区别技术特征，而这些区别技术特征可由本领域普通技术人员基于另一篇对比文件公开的内容并结合公知常识而得到，并且该权利要求的技术方案并没有由于这些区别技术特征而具有预料不到的技术效果，则该项权利要求相对于上述对比文件没有突出的实质性特点和显著的进步，不具有创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201611075628.3，名称为“一种口蹄疫病毒胶体金试纸条、病原快速检测试剂盒及其制备方法”的发明专利申请（下称本申请），本申请的申请日为2016年11月30日，公开日为2017年05月31日，申请人为江苏博爱生物科技有限公司。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2018年09月03日发出驳回决定，驳回了本申请，其理由是：权利要求1-4不具备专利法第22条第3款规定的创造性。驳回决定引用如下3篇对比文件：
对比文件1：CN 205157564U，公告日期为2016年04月13日；
对比文件2：CN 1877331A，公开日期为2006年12月13日；
对比文件3：CN 101067627A ，公开日期为2007年11月07日。
驳回决定所依据的文本为：申请日2016年11月30日提交的说明书摘要、说明书附图1-4、摘要附图；2017年04月12日提交的说明书第1-98段；2018年03月07日提交的权利要求第1-4项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种口蹄疫病毒胶体金试纸条，包括背衬、硝酸纤维素膜、吸水垫、金标垫、样品垫，所述背衬板设在最底部，硝酸纤维素膜设置于衬板上部中央，硝酸纤维素膜上部右端贴有吸水垫，硝酸纤维素膜上部左端设有金标垫，金标垫的上部左端设有样品垫，其特征在于，所述的硝酸纤维素膜上右端设有兔抗鼠免疫球蛋白作为质控带，硝酸纤维素膜上左端设有口蹄疫病毒多克隆抗体作为检测带，金标垫上喷有胶体金标记的口蹄疫病毒单克隆抗体；所述金标垫与样品垫之间有交叠，所述吸水垫和金标垫与硝酸纤维素膜的衔接处有交叠；所述胶体金标记的口蹄疫单克隆抗体为口蹄疫O型群特异性单克隆抗体；所述检测带的口蹄疫病毒抗体为多克隆抗体；所述的口蹄疫病毒胶体金试纸条的制备方法，包括以下步骤：
1)制备胶体金：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；
2)制备胶体金标记的口蹄疫病毒单克隆抗体：调节步骤1)胶体金的pH值，将口蹄疫病毒单克隆抗体溶液加入胶体金溶液，以牛血清白蛋白饱和游离胶体金，离心即得胶体金标记的口蹄疫病毒单克隆抗体；
3)组装口蹄疫病毒胶体金试纸条：制备含有检测带和质控带的硝酸纤维素膜，并制备胶体金垫，分别将背衬板、样品垫、胶体金垫，包括检测带、质控带的硝酸纤维素膜以及吸水垫按由下至上顺序装配，剪切成条状，即制成不同型口蹄疫病毒诊断试纸条；
所述步骤2)制备胶体金标记的口蹄疫病毒单克隆抗体的方法为：用0.2mol/LK2CO3或0.1mol/LHC1调节步骤1)获得的胶体金溶液的pH为8.4～8.7；
在磁力搅拌下，将口蹄疫病毒单抗溶液加入50mL胶体金溶液中，加入单抗时应逐滴加入，l mg的单抗蛋白质大约5min加完。在最低稳定量(20μg/ml)的基础再加10％～20％即为待标记单抗的实际用量；
在磁力搅拌器下，加入终浓度为1％(w/v)的牛血清白蛋白(BSA)以饱和游离的胶体金，继续搅拌30min；
先将金标抗体用1500r/min低速离心1h，弃去沉淀；将离心获得的上清再以15000r/min第二次离心1h，弃去上清；将第二次离心获得的沉淀以原体积的0.02mol/LTBS pH8.2(内含1％BSA,0.05％叠氮钠)溶解后，重复离心2-3 次，沉淀溶于原体积的1/10TBS中，即获得胶体金标记的口蹄疫病毒单克隆抗体。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤3)中含有检测带(7)和质控带(6)的硝酸纤维素膜(2)的方法为：用浓度为(1.5-2.5mg/mL)纯化的FMDV多抗和兔抗鼠免疫球蛋白(0.8-1.2mg/mL)分别用划膜仪划在硝酸纤维膜上。分别作为检测线和对照线，点样量为0.75μL/cm，37℃干燥2h，4℃密封保存备。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤3)中制备胶体金垫的方法为使用步骤2)获得的胶体金标记的口蹄疫病毒单克隆抗体，用划膜喷金仪喷于玻璃纤维素膜上，喷样量为1.5-2.0μL/cm，于4℃真空抽干，加入干燥剂或变色硅胶，密封保存于4℃冰箱中。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的胶体金溶液的配制：取2gBSA，溶解于45mL去离子水中；取1gPVP，溶解于20mL去离子水；取1gPEG溶解于20mL去离子水；取2g脱脂奶粉，溶解于45mL去离子水；8mL 5％酪蛋白溶液，溶解后，12500±200r/min离心30min,取上清备用；取0.8L去离子水，加入6.4g柠檬酸，6.06g trizma base，2.8g NaOH，充分混合，调节pH至8.1±0.05；加入0.2g NaN3，3g Tween-20，25g蔗糖，6.25g海藻糖；将所有的上述液体加入到最后一个溶液中充分混合；用三蒸去离子水补平至1L。”
驳回决定主要认为：1.权利要求1与对比文件1的区别在于：（1）金标抗体为口蹄疫O型群特异性单克隆抗体；（2）试纸条的制备方法；（3）金标抗体的制备方法。针对区别特征（1），采用O型口蹄疫病毒制备群特异性单克隆抗体对口蹄疫病毒进行检测是本领域的常规技术。对于区别特征（2）、（3），对比文件2公开了口蹄疫病毒定型试纸条及其制备方法，基于对比文件2的教导本领域技术人员容易想到参考基于相同原理同样检测口蹄疫病毒的对比文件2中的方法制备对比文件1中的试纸条。对比文件3公开了Asia I型口蹄疫病毒快速诊断试纸条及其制备方法，基于对比文件3的教导本领域技术人员容易想到参照对比文件3所公开方法制备对比文件1中检测口蹄疫病毒的胶体金试纸条的金标抗体，并对试验参数进行调整。因此，权利要求1相对于对比文件1-3和公知常识的结合不具备专利法第22条第3款规定的创造性。2.从属权利要求2-4的附加技术特征是本领域技术人员基于对比文件2公开的内容容易想到的，因此权利要求2-4也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
申请人江苏博爱生物科技有限公司（下称复审请求人）对上述驳回决定不服,于2018年12月18日向国家知识产权局提出了复审请求，并未对申请文件进行修改。复审请求人认为：（1）对比文件2虽然公开了口蹄疫病毒定型试纸条的制备方法但未给出胶体金与待标记抗体用量配比。并且不同血清型的口蹄疫病毒免疫胶体金的制备方法存在差异，在其实施例给出了以O型口蹄疫豚鼠IgG标记胶体金时，调节胶体金pH为8.2，本领域技术人员为了使得O型口蹄疫免疫球蛋白标记胶体金，容易想到的是将pH设置为8.2。对比文件3虽然公开了胶体金标记抗体最适稳定量的优化，但并未给出其他血清型的口蹄疫单抗仍能使用所公开的Asia I型口蹄疫单克隆抗体胶体金的制备方法的技术启示，也未指出用于不同单抗时如何改进能够获得胶体金标记其他抗体的最适稳定量。对于创造性评价应针对整体技术方案进行。（2）本领域技术人员通常会将pH作为调整制备稳定的胶体金标记的口蹄疫病毒单克隆抗体的唯一方法，本申请将单抗蛋白用量作为本申请能够完成与实现的重要因素，在制备胶体金标记的口蹄疫病毒单克隆抗体的过程中使用特定的胶体金抗体制备方法使得胶体金试纸条具备稳定性的前提下，同时具有足够的灵敏度，即在4℃可以保存7个月和室温下保存半年，对纯化FMDV抗原的最低检出量为0.31μg/mL。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年12月24日依法受理了该复审请求，并将本案转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局依法成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年06月14日向复审请求人发出复审通知书，指出：1.权利要求1与对比文件2的区别在于：（1）权利要求1检测带上为口蹄疫病毒多克隆抗体，质控带为兔抗鼠免疫球蛋白，金标垫上为金标记的口蹄疫病毒O型群特异性单克隆抗体；对比文件2中检测带为O型口蹄疫病毒IgG，质控带为兔抗豚鼠IgG，金标垫上为金标记的O型口蹄疫病毒IgG；（2）权利要求1与对比文件2关于胶体金标记抗体的制备方法不同，并且试纸条的制备方法中具体参数有所不同，例如胶体金溶液pH值等。针对区别特征（1），对比文件2给出了金标垫上金标抗体为O型口蹄疫单克隆抗体的技术启示。并且多克隆抗体和单克隆抗体的制备方法是本领域公知的，本领域技术人员可以显而易见地得到O型口蹄疫病毒抗体，兔抗鼠IgG作为质控带也是本领域的常规技术。针对区别特征（2），对比文件3给出了在制备胶体金标记抗体的过程中进行抗体量优化的技术启示，本领域技术人员基于对比文件3的教导，有动机对抗体的量进行优化并采用与对比文件3类似的方法进行胶体金标记抗体的制备。并且本领域技术人员可根据待标记抗体的不同对试纸条制备方法中其他具体参数进行一定调整。因此，权利要求1相对于对比文件2、3和公知常识的结合不具备专利法第22条第3款规定的创造性。2.从属权利要求2-4的附加技术特征是本领域技术人员基于对比文件2公开的内容容易得到的，因此权利要求2-4也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
复审请求人于2019年07月04日提交了意见陈述书，并提交了权利要求书全文修改替换页。修改涉及：基于复审通知书所针对的文本，将从属权利要求2、3的附加技术特征加入权利要求1中，删除了权利要求2、3并进一步调整了权利要求序号。修改后的权利要求书共包括权利要求1、2项，其内容为：
“1. 一种口蹄疫病毒胶体金试纸条，包括背衬、硝酸纤维素膜、吸水垫、金标垫、样品垫，所述背衬板设在最底部，硝酸纤维素膜设置于衬板上部中央，硝酸纤维素膜上部右端贴有吸水垫，硝酸纤维素膜上部左端设有金标垫，金标垫的上部左端设有样品垫，其特征在于，所述的硝酸纤维素膜上右端设有兔抗鼠免疫球蛋白作为质控带，硝酸纤维素膜上左端设有口蹄疫病毒多克隆抗体作为检测带，金标垫上喷有胶体金标记的口蹄疫病毒单克隆抗体；所述金标垫与样品垫之间有交叠，所述吸水垫和金标垫与硝酸纤维素膜的衔接处有交叠；所述胶体金标记的口蹄疫单克隆抗体为口蹄疫O型群特异性单克隆抗体；所述检测带的口蹄疫病毒抗体为多克隆抗体；所述的口蹄疫病毒胶体金试纸条的制备方法，包括以下步骤：
1)制备胶体金：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；
2)制备胶体金标记的口蹄疫病毒单克隆抗体：调节步骤1)胶体金的pH值，将口蹄疫病毒单克隆抗体溶液加入胶体金溶液，以牛血清白蛋白饱和游离胶体金，离心即得胶体金标记的口蹄疫病毒单克隆抗体；
3)组装口蹄疫病毒胶体金试纸条：制备含有检测带和质控带的硝酸纤维素膜，并制备胶体金垫，分别将背衬板、样品垫、胶体金垫，包括检测带、质控带的硝酸纤维素膜以及吸水垫按由下至上顺序装配，剪切成条状，即制成不同型口蹄疫病毒诊断试纸条；
所述步骤2)制备胶体金标记的口蹄疫病毒单克隆抗体的方法为：用0.2mol/L K2CO3或0.1mol/L HC1调节步骤1)获得的胶体金溶液的pH为8.4～8.7；
在磁力搅拌下，将口蹄疫病毒单抗溶液加入50mL胶体金溶液中，加入单抗时应逐滴加入，1mg的单抗蛋白质大约5min加完。在最低稳定量(20μg/ml)的基础再加10％～20％即为待标记单抗的实际用量；
在磁力搅拌器下，加入终浓度为1％(w/v)的牛血清白蛋白(BSA)以饱和游离的胶体金，继续搅拌30min；
先将金标抗体用1500r/min低速离心1h，弃去沉淀；将离心获得的上清再以15000r/min第二次离心1h，弃去上清；将第二次离心获得的沉淀以原体积的0.02mol/L TBS pH8.2(内含1％BSA,0.05％叠氮钠)溶解后，重复离心2-3次，沉淀溶于原体积的1/10 TBS中，即获得胶体金标记的口蹄疫病毒单克隆 抗体；
所述步骤3)中含有检测带(7)和质控带(6)的硝酸纤维素膜(2)的方法为：用浓度为(1.5-2.5mg/mL)纯化的FMDV多抗和兔抗鼠免疫球蛋白(0.8-1.2mg/mL)分别用划膜仪划在硝酸纤维膜上。分别作为检测线和对照线，点样量为0.75μL/cm，37℃干燥2h，4℃密封保存备；
所述步骤3)中制备胶体金垫的方法为使用步骤2)获得的胶体金标记的口蹄疫病毒单克隆抗体，用划膜喷金仪喷于玻璃纤维素膜上，喷样量为1.5-2.0μL/cm，于4℃真空抽干，加入干燥剂或变色硅胶，密封保存于4℃冰箱中。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的胶体金溶液的配制：取2g BSA，溶解于45mL去离子水中；取1g PVP，溶解于20mL去离子水；取1g PEG溶解于20mL去离子水；取2g脱脂奶粉，溶解于45mL去离子水；8mL 5％酪蛋白溶液，溶解后，12500±200r/min离心30min,取上清备用；取0.8L去离子水，加入6.4g柠檬酸，6.06g trizma base，2.8g NaOH，充分混合，调节pH至8.1±0.05；加入0.2g NaN3，3g Tween-20，25g蔗糖，6.25g海藻糖；将所有的上述液体加入到最后一个溶液中充分混合；用三蒸去离子水补平至1L。”
复审请求人认为：(1)由于单克隆抗体的特异性强，减少了可能的交叉反应，在现有技术中许多试剂盒都是由单抗制成。对比文件2中检测带为单克隆抗体，对比文件3的检测线上是AsiaI型口蹄疫病毒单抗。多克隆抗体虽为本领域熟知的抗体，但基于现有技术本领域技术人员不会采用多克隆抗体。本申请的试纸条检测口蹄疫病毒所达到的技术效果是难以预料的。（2）对比文件2公开了检测线和质控线喷涂量为1.8-2.0μL/cm，胶体金标垫上的抗体喷涂量为10-20μL/cm，并且对比文件2也未给出改变喷涂量的技术启示。而本申请的检测线和质控线喷涂量及胶体金标垫上的抗体喷涂量较对比文件2显著减少，试纸条不仅具有很强的特异性，重复性、稳定性很好，室温可保存半年，并且显著降低了检测成本。（3）对比文件2公开了以O型口蹄疫豚鼠IgG标记胶体金时，调节胶体金溶胶pH为8.2，本领域技术人员显而易见地是将pH设置为8.2.对比文件3虽然给出了胶体金的制备方法及胶体金标记抗体最适稳定量的测定，但其是基于Asia I型口蹄疫单克隆抗体的制备，并未记载所述制备方法还能够用于其他单克隆抗体的制备，及其他抗体与胶体金稳定标记量测定的关系。并且，本领域技术人员通常会将pH作为调整制备稳定的胶体金标记的口蹄疫病毒单克隆抗体的唯一方法，本申请将单抗蛋白用量作为本申请能够完成与实现的重要因素，在制备胶体金标记的口蹄疫病毒单克隆抗体的过程中使用特定的胶体金抗体制备方法使得胶体金试纸条具备稳定性的前提下，同时具有足够的灵敏度。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，依法作出审查决定。
二、决定的理由
（一）审查文本的认定
在复审程序中，复审请求人于2019年07月04日提交了权利要求书的全文修改替换页，经审查，其中所作的修改符合专利法第33条及专利法实施细则第61条第1款的规定。因此，本决定以申请日2016年11月30日提交的说明书摘要、说明书附图1-4、摘要附图；2017年04月12日提交的说明书第1-98段；2019年07月04日提交的权利要求第1、2项为基础作出。
（二）关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。
如果一项权利要求与作为最接近现有技术的对比文件相比存在区别技术特征，而这些区别技术特征可由本领域普通技术人员基于另一篇对比文件公开的内容并结合公知常识而得到，并且该权利要求的技术方案并没有由于这些区别技术特征而具有预料不到的技术效果，则该项权利要求相对于上述对比文件没有突出的实质性特点和显著的进步，不具有创造性。
具体到本案，合议组认为：
1. 权利要求1要求保护一种口蹄疫病毒胶体金试纸条。
对比文件2公开了一种口蹄疫病毒定型试纸条及其制备和使用方法（参见对比文件2说明书第2，3，5页、实施例1）。该试纸条由O、A、Asia I、C四种血清型检测试纸条组成。试纸条由PVC衬板、硝酸纤维素膜、吸收垫、金标垫、样品垫组成。PVC衬板设在最底部，衬板上部中段设有硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上部左端贴有吸收垫，硝酸纤维素膜上部右端设有金标垫，金标垫的上部右端设有样品垫。硝酸纤维素膜上左端喷有兔抗豚鼠IgG抗体为质控带；硝酸纤维素膜上右端喷有口蹄疫O型IgG抗体为检测带；金标垫上喷有胶体金标记的口蹄疫O型抗体。吸水纸和金标垫与硝酸纤维素膜有0.1cm交叠，金标垫与样品垫也有0.1cm交叠。O型口蹄疫诊断试纸条的制备方法包括：（1）胶体金的制备：采用柠檬酸三钠还原法；（2）免疫胶体金的制备：用0.1mol/L K2CO3调节胶体金溶胶至所需pH为8.2，按45μg/mL胶体金加入O型口蹄疫豚鼠IgG，磁力搅拌15min。在胶体金溶液中按1％加入牛血清白蛋白，继续搅拌15min，将上述胶体金经3000r/min离心15分钟去除沉淀物，得上清液；将上清液经10000r/min高速离心1h得到沉淀物，将沉淀悬浮于8/100 初始胶体金体积的含10％蔗糖、1％BSA、1‰PEG20000、1‰Tween-20的pH7.5 0.11mol/L PBS金胶缓冲液中，悬浮溶解，置4℃保存；（3）口蹄疫定型诊断试纸条的制备方法：(3.1)制备含有检测带和质控带的硝酸纤维素膜: 分别将纯化的O型FMDV兔IgG调整至浓度为 2.2mg/mL，兔抗豚鼠IgG浓度调整为1.0mg/mL，分别按1.8μL/cm将两种IgG喷涂于NC膜上，形成检测带与质控带，封闭稳定后37℃烘干1h，保存备用；（3.2）制备胶体金垫：取玻璃纤维纸，用喷膜机按15μL/cm，将胶体金标记的O型FMDV豚鼠IgG，喷涂于玻璃纤维纸上，干燥后贮存备用；（3.3）试纸条的组装：在PVC背衬板分别将吸取样品用的样品吸收垫、固定有胶体金标记O型口蹄疫抗体的胶体金垫，包被检测带、质控带的硝酸纤维素膜以及吸水滤纸制成的吸收垫按由下至上装配，剪切成条状，即制成O型口蹄疫病毒（FMDV）诊断试纸条。
由此，对比文件2同样公开了一种口蹄疫病毒胶体金试纸条及其制备方法，该试纸条按照如其图1所示从右到左的顺序其组成结构与权利要求1所述的试纸条完全相同。
权利要求1与对比文件2的区别在于：（1）权利要求1检测带上为口蹄疫病毒多克隆抗体，质控带为兔抗鼠免疫球蛋白，金标垫上为金标记的口蹄疫病毒O型群特异性单克隆抗体；对比文件2中检测带为O型口蹄疫病毒IgG，质控带为兔抗豚鼠IgG，金标垫上为金标记的O型口蹄疫病毒IgG；（2）权利要求1与对比文件2关于胶体金标记抗体的制备方法不同，并且试纸条的制备方法中具体参数有所不同，例如胶体金溶液pH值，检测带、质控带的喷涂量以及金标抗体的喷涂量等。基于上述区别特征，权利要求1实际解决的技术问题为：提供另外一种O型口蹄疫金标试纸条。
针对区别特征（1），对比文件2中明确指出：硝酸纤维素膜和金标垫上喷有的口蹄疫O、A、C、Asia I型抗体为兔或豚鼠口蹄疫病毒抗体或口蹄疫病毒单克隆抗体（参见对比文件2说明书第2页），由此对比文件2已给出金标垫上金标抗体为O型口蹄疫单克隆抗体的技术启示。并且不论是多克隆抗体还是单克隆抗体的制备方法均是本领域技术人员熟知的，得到O型口蹄疫病毒抗体不能使本申请权利要求的技术方案具备创造性。如上所述，对比文件2已公开质控带为兔抗豚鼠IgG，而得到兔抗鼠IgG作为质控带也是本领域的常规技术。
对于区别特征（1）中抗体的选择，复审请求人认为：由于单克隆抗体的特异性强，减少了可能的交叉反应，在现有技术中许多试剂盒都是由单抗制成。对比文件2中检测带为单克隆抗体，对比文件3的检测线上是AsiaI型口蹄疫病毒单抗。多克隆抗体虽为本领域熟知的抗体，但基于现有技术本领域技术人员不会采用多克隆抗体。本申请的试纸条检测口蹄疫病毒所达到的技术效果是难以预料的。对此，合议组认为：多克隆抗体和单克隆抗体是免疫检测技术中常用的抗体类型。单克隆抗体纯度较高、效价高，针对单一抗原决定簇，对单一表位稳定，保存的稳定性略差，适用于微量检测；多克隆抗体针对多决定簇，具有多表位异质性，保存的稳定性良好，适用于常规检测。本领域技术人员可根据检测的实际需要、检测成本等综合考虑，选择检测所需要的抗体类型。并且，不论是单克隆抗体还是多克隆抗体的制备方法是本领域技术人员熟知的，从技术发展的历史来看，多克隆抗体和胶体金免疫层析技术的发展都先于单克隆抗体产生，在单克隆抗体技术发展初期由于产量、成本等因素限制，多抗才是胶体金技术及其他免疫检测技术中的主流，而后才发展到单克隆抗体的使用，但这并不代表多抗已经被检测技术淘汰，而是发展到现在和单抗一同为免疫检测技术提供了更多的选择，所以得到口蹄疫病毒相应的多克隆抗体并不需要克服技术上的难点，更进一步的，本申请说明书中也未给出实验数据表明本申请所用的多克隆抗体是经筛选而得到的可产生预料不到技术效果的抗体，因此本申请中所用的口蹄疫病毒多克隆抗体并不能使本申请技术方案具备创造性。
针对区别特征（2），对比文件3（参见对比文件3摘要、说明书第3,6,7页）公开了一种Asia I型口蹄疫病毒快速诊断试纸条及其制备方法。该制备方法包括：确定金标抗体最适稳定量，在此基础上再补加10%的单抗溶液，即为稳定胶体金所需抗体实际用量。具体做法为：根据所确定的单抗用量，在电磁搅拌器搅拌下，缓慢将单抗溶液加入胶体金溶液中，1mg的抗体大约用5min 加完，加完后继续搅动20min。在搅拌状态下继续加入过滤的牛血清白蛋白 (BSA)使其终浓度为1％，再缓慢搅动20min。胶体金标记抗体的纯化：将胶体金标记抗体于1500rpm离心15min，弃沉淀留上清。将上清移入新的离心管后15000rpm于4℃离心40min，弃上清留沉淀。用与离心前相同体积的0.02M TBS(0.02M氯化钠，0.02M Tris，0.4mL 冰醋酸，pH8.6)溶解沉淀，重复离心2-3次后，用原体积8％的0.02M TBS溶解沉淀，4℃保存备用。由此，对比文件3给出了在制备胶体金标记抗体的过程中进行抗体量优化的技术启示，本领域技术人员基于对比文件3的教导，有动机对抗体的量进行优化并采用与对比文件3类似的方法进行胶体金标记抗体的制备。并且本领域技术人员可根据待标记抗体的不同对试纸条制备方法中其他具体参数进行一定调整，例如通常根据待标记蛋白质的等电点将胶体金溶液的pH值调至该等电点略偏碱，这样的调整是本领域技术人员应具备的实验技能，并不需要付出创造性劳动。
复审请求人认为：对比文件2公开了检测线和质控线喷涂量为1.8-2.0μL/cm，胶体金标垫上的抗体喷涂量为10-20μL/cm，并且对比文件2也未给出改变喷涂量的技术启示。而本申请的检测线和质控线喷涂量及胶体金标垫上的抗体喷涂量较对比文件2显著减少，试纸条不仅具有很强的特异性，重复性、稳定性很好，室温可保存半年，并且显著降低了检测成本。对此，合议组认为：本申请申请日前，免疫层析试纸的制备技术在本领域中已成为常规技术。通常层析膜上蛋白溶液的点样参考量为大约1μL/cm，胶体金垫上标记物的喷涂量通常为2-16μL/cm。本申请中选择检测带、质控带的喷涂量为0.75μL/cm，胶体金标垫上标记抗体的喷涂量为1.5-2μL/cm都未超出本领域技术人员对蛋白质溶液及标记物常规喷涂量的认知范围，因此本申请中对于检测线、质控线喷涂量及胶体金标垫上标记抗体的喷涂量的选择是常规选择，减少喷涂量所实现的降低检测成本的效果是本领域技术人员可预期的。
复审请求人认为：对比文件2公开了以O型口蹄疫豚鼠IgG标记胶体金时，调节胶体金溶胶pH为8.2，本领域技术人员显而易见地是将pH设置为8.2.对比文件3虽然给出了胶体金的制备方法及胶体金标记抗体最适稳定量的测定，但其是基于Asia I型口蹄疫单克隆抗体的制备，并未记载所述制备方法还能够用于其他单克隆抗体的制备，及其他抗体与胶体金稳定标记量测定的关系。并且，本领域技术人员通常会将pH作为调整制备稳定的胶体金标记的口蹄疫病毒单克隆抗体的唯一方法，本申请将单抗蛋白用量作为本申请能够完成与实现的重要因素，在制备胶体金标记的口蹄疫病毒单克隆抗体的过程中使用特定的胶体金抗体制备方法使得胶体金试纸条具备稳定性的前提下，同时具有足够的灵敏度。对此，合议组认为：首先，对于胶体金标记抗体过程中是否进行抗体用量优化，对比文件2公开了一种口蹄疫病毒胶体金试纸条及其制备方法，其中包括O型口蹄疫诊断试纸条，当本领域技术人员需要制备口蹄疫病毒胶体金试纸条时有动机应用对比文件2所述的制备方法来制备胶体金试纸条。同时，对比文件3给出了在制备胶体金标记抗体的过程中进行抗体量优化的技术启示，本领域技术人员基于对比文件3的教导，有动机针对O型口蹄疫单克隆抗体对其使用量进行优化并采用与对比文件3类似的方法进行胶体金标记抗体的制备。并且，对于本领域技术人员来说，免疫层析试纸各组成部分的制备是常规的技术，可根据需要对该制备方法中一些参数或组分进行调整和优化。例如通常根据待标记蛋白质的等电点将胶体金溶液的pH值调至该等电点略偏碱，这样的调整是本领域技术人员应具备的实验技能，因此确定胶体金溶液的pH值并不需要付出创造性劳动。基于现有技术给出的这些技术启示，本领域技术人员有动机在需要获得口蹄疫胶体金试纸时改进对比文件2并获得如权利要求1所述的技术方案。其次，对于抗体用量优化方法的具体适用对象，对比文件3虽然公开的是Asia I型口蹄疫诊断试纸条及其制备方法，但其中所公开的胶体金抗体的制备方法的技术思路具有普适性，为本领域制备胶体金标记蛋白质的常规方法，本领域技术人员在制备O型口蹄疫胶体金试纸条时，有动机应用这一方法体系并对其进行适应性调整而制备获得胶体金标记的O型口蹄疫抗体。胶体金标记蛋白质的制备可具体参见以下文献：李天星，《现代临床医学免疫学检测技术》，2014年出版，第86-90页，其中记载了胶体金标记蛋白质过程中需要考虑的因素包括：待标记蛋白质的结构、标记pH值、反应温度、电解质体系、标记蛋白最适稳定量的选择等。标记蛋白最适稳定量的优化方法与对比文件3所述的目测法基本相同，实际使用量在最适稳定量的基础上再加20%。并且蛋白质的胶体金标记过程为：在磁力搅拌下，将蛋白质溶液缓慢加入胶体金溶液中，加入蛋白质时应逐滴加入，1mg的蛋白质大约5min加完。该标记过程与本申请所述的标记过程相同。由此可见，权利要求1中胶体金标记抗体的制备方法并不是本申请的首创，其沿用了本领域中胶体金标记蛋白质的常规方法。
因此，对于本领域普通技术人员来说，在对比文件2的基础上结合对比文件3、公知常识得出权利要求1的技术方案是显而易见的，因此权利要求1不具有突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
2. 权利要求2是权利要求1的从属权利要求，对胶体金溶液的制备进行了进一步限定。对比文件2中胶体金缓冲液为含10％蔗糖、1％BSA、1‰PEG20000、1‰Tween-20的pH7.5 0.11mol/L PBS金胶缓冲液（参见说明书实施例1）。对于本领域技术人员来说，免疫层析试纸各组成部分的制备是成熟技术，可根据需要对胶体金溶液组分及其制备方法进行调整和优化。因此，在其所引用的权利要求不具备创造性的情况下，权利要求2也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
基于上述理由，合议组依法作出下述决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2018年09月03日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，请求人自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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