发明创造名称：具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白及其制备方法
外观设计名称：
决定号：195816
决定日：2019-11-18
委内编号：1F252945
优先权日：
申请（专利）号：201610416328.0
申请日：2016-06-15
复审请求人：无锡市人民医院
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：肖晶
合议组组长：吴通义
参审员：田甜
国际分类号：
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：在判断创造性时，首先要将权利要求所要求保护的技术方案与最接近的现有技术相比较，确定区别技术特征和发明实际解决的技术问题，进而考察现有技术中是否存在将该区别技术特征引入到所述最接近的现有技术中以解决上述技术问题的启示，如果存在这样的启示，则该权利要求不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201610416328.0，名称为“具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白及其制备方法”的发明专利申请。申请人为无锡市人民医院。本申请的申请日为2016年06月15日，公开日为2016年11月09日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2018年02月13日发出驳回决定，驳回了本发明专利申请，其理由是：权利要求1-10相对于对比文件1 (A novel cell-penetrating peptide suppresses breast tumorigenesis by inhibiting β-catenin/LEF-1 signaling，Tsung-Hua Hsieh等，SCIENTIFIC REPORTS，第6卷，公开日为2016年01月11日)、对比文件2（Regulation of β-catenin structure and activity by tyrosine phosphorylation，Piedra J等，J BIOL CHEM，第276卷第23期，第20436-20443页，公开日为2001年03月13日）、对比文件3（Genbank: NP001185459，公开日为2016年02月03日）、对比文件4（CN101932608A，公开日为2010年12月29日）以及本领域常规技术手段的结合，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。驳回决定所依据的文本为申请日提交的权利要求书第1-10项、说明书摘要、说明书第1-86段；2016年08月03日提交的说明书附图如图1-图8、说明书核苷酸和氨基酸序列表。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白，其特征在于，将能与β-catenin结合的转录因子TCF4的氨基端(N端)的80个氨基酸序列命名为N240，在N240的N端连接核定位肽NLS，在N240的C端连接穿膜信号肽TAT，在NLS和N240之间加入His-FLAG标签，所述具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白功能区代号为：NLS-His-FLAG-N240-TAT；
所述具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白全长132个氨基酸，其中1～25为NLS序列，26～39为His-FLAG标签序列，42～121为N240序列，122～132为TAT序列，所述His-FLAG标签序列与所述N240序列之间用RS两个氨基酸进行连接；
所述具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的氨基酸序列为：
2. 如权利要求1所述的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白，其特征在于，所述具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白对应的碱基序列为：
3. 一种如权利要求1所述的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括：
(1)NLS-His-FLAG-N240-TAT基因的克隆
以pcDNA/Myc-TCF4载体为模板用高保真PCR扩增试剂盒扩增含TCF4前80个氨基酸的N240序列，在上下游引物中分别引入His-Flag序列和TAT序列，在N端引入NLS序列，得到初级PCR产物，以所述初级PCR产物为模板扩增最终的NLS-His-FLAG-N240-TAT序列，而后在最终的NLS-His-FLAG-N240-TAT序列两端分别引入内切酶Hind III和Kpn I酶切位点，得到PCR产物，
用所述内切酶Hind III和Kpn I酶切所述PCR产物，再用胶回收试剂盒回收，得到PCR酶切产物；
用所述内切酶Hind III和Kpn I酶切所述PCR产物，经1％琼脂糖凝胶电泳后用质粒抽提试剂盒回收，得到质粒酶切产物pcDNA3.1质粒；
在温度为3～5℃的环境下采用T4DNA连接酶将所述PCR酶切产物和所述质粒酶切产物pcDNA3.1质粒连接过夜，而后转化至E.coli Dh5α感受态细胞后涂布到含50μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上，在温度为36～38℃的环境下培养过夜；
挑取单菌落，LB固体培养基过夜培养后通过PCR初筛阳性克隆、质粒抽提试剂盒抽提，得到阳性质粒：pcDNA3.1-NLS-His-FLAG-N240-TAT；
(2)HEK293细胞的转染与表达
将pcDNA3.1-NLS-His-FLAG-N240-TAT通过脂质体转染试剂转染HEK293细胞48小时后，加入新霉素进行加压筛选，构建表达NLS-His-FLAG-N240-TAT基因的HEK293稳转细胞株；
(3)NLS-His-FLAG-N240-TAT重组蛋白的分离纯化
对所述HEK293稳转细胞株进行扩大培养，而后收集细胞并抽提细胞总蛋白，蛋白抽提液用0.45μm的滤器过滤，使用Ni柱纯化带有His标签的重组蛋白；
具体过程如下：转移树脂到Ni柱，待完全沉淀后，用双蒸水洗涤镍亲和层析柱，并防止下一步Ni2 沉淀；用ddH2O洗涤，除尽基质中的空气；10×柱体积的Binding buffer平衡；上样；10×柱体积的Binding buffer洗涤，收集流出液；Elution buffer洗脱，进一步超滤浓缩后得到所述具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白。
4. 如权利要求3所述的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述内切酶Hind III酶切位点对应的碱基序列为：AAGCTT。
5. 如权利要求3所述的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述内切酶Kpn I酶切位点对应的碱基序列为：GGTACC。
6. 如权利要求3所述的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，在温度为4℃的环境下采用T4DNA连接酶将所述PCR酶切产物和所述质粒酶切产物pcDNA3.1质粒连接过夜。
7. 如权利要求3所述的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，在温度为37℃的环境下培养过夜。
8. 如权利要求3所述的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，在得到阳性质粒：pcDNA3.1-NLS-His-FLAG-N240-TAT后，对所述阳性质粒进行测序，以验证基因克隆的正确性。
9. 如权利要求3所述的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，在构建表达NLS-His-FLAG-N240-TAT基因的HEK293稳转细胞株后，还通过Western blot检测NLS-His-FLAG-N240-TAT蛋白的表达。
10. 如权利要求3所述的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的制备方法，其特征在于，还包括：将所述具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白经 SDS-PAGE电泳、转膜后，通过His单抗对所述具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白进行鉴定。 ”
申请人（下称复审请求人）对上述驳回决定不服,于2018年05月25日向国家知识产权局提出了复审请求，没有修改权利要求书。复审请求人认为：（1）对比文件1中的融合肽通过阻止β-catenin 与LEF-1之间的反应从而抑制乳腺癌细胞的生长，而本申请的融合肽除了能阻断TCF4与β-catenin的反应，还能够阻断TCF4与其他癌基因的结合从而有效的抑制肿瘤干细胞；对比文件2也并未公开β-catenin与TCF结合后不仅能阻断TCF4与β-catenin的反应，还能阻断TCF4与其他癌基因的结合；（2）本申请中融合肽的元件连接顺序与对比文件1中不同，不同的连接顺序会造成效果的不同；（3）连接肽的设计和选择会影响生物学功能的发挥，对比文件1中未引入连接肽，本领域技术人员不会显而易见将对比文件4与对比文件1结合。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年06月05日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年06 月19 日向复审请求人发出复审通知书，指出：权利要求1和对比文件1的区别为：⑴权利要求1中与β-catenin结合的序列为N240（TCF的N端前80个氨基酸），对比文件1中与β-catenin结合的序列为BLBD（即LEF-1中与β-catenin结合的片段）；⑵权利要求1还包含His-FLAG标签、连接肽RS，以及各片段连接顺序不同。根据说明书记载的内容和区别技术特征，本申请解决的技术问题是：提供了一种效果类似的结合β-catenin的重组蛋白。对于区别⑴，对比文件2公开了β-catenin是在胚胎发生早期控制细胞命运的Wnt信号通路的关键组分，激活该途径导致游离β-catenin的稳定化、易位到细胞核，以及与LEF-1/TCF家族转录因子的结合。β-catenin与这些因子反应并将其转变成转录激活因子，刺激启动子中包括TCF-4应答序列的一系列基因的表达。以及，TCF 4的β-catenin结合结构域（TCF-4（1-80））能够与β-catenin结合（参见摘要第3段，第2页第2段β-连环蛋白结合分析，图2），即，对比文件2给出了TCF4蛋白的氨基端80个氨基酸是能与β-catenin结合的结合结构域以及Wnt信号通路中β-连环蛋白与LEF-1/TCF结合后能够激活下游反应的技术启示，在此基础上，本领域技术人员能够想到以TCF4的β-catenin结合结构域（即氨基端的80个氨基酸）代替LEF-1的β-catenin结合结构域（即BLBD），从而与TAT和NLS制备成融合肽，也可以达到阻止β-catenin/ TCF-4/LEF-1复合体形成和抑制癌细胞生长的作用。同时，对比文件3公开了一种人源TCF-4的氨基酸序列，其中的第1-80位氨基酸与权利要求1中N240的氨基酸序列仅相差1个氨基酸，具有98％以上的序列同一性。在此基础上，本领域技术人员能够通过常规技术手段获得与之序列结构高度相似且功能相同的TCF-4结合结构域。对于区别⑵，为了后续纯化步骤，增加组氨酸标签是本领域技术人员的常用技术。类似的，使用连接肽连接两段氨基酸序列，可使两侧的序列各自正确地折叠，从而产生正确的生物学结构和空间构象，发挥各自的生物学效能属于本领域的普通技术知识，对比文件4公开了融合肽中连接两段氨基酸序列的接头可以为‘RS’。本领域技术人员知晓，核定位肽NLS、穿膜信号肽TAT、纯化标签His-FLAG与其他功能蛋白制备融合肽时，连接在功能蛋白的上游或下游，均能够发挥其功能效果，因而，具体的连接方式是本领域技术人员通过常规技术手段可以选择确定的。因此，在对比文件1的基础上结合对比文件2-4以及本领域常规技术手段获得权利要求1要求保护的技术方案对本领域技术人员来说是显而易见的，权利要求1要求保护的技术方案不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。权利要求2限定了具体序列，根据密码子规则确定氨基酸序列的碱基序列是本领域的常规技术手段；权利要求3-10请求保护如权利要求1 所述重组蛋白的制备方法，克隆重组表达重组蛋白的步骤是本领域的常规技术手段，在权利要求1不具备创造性的基础上，权利要求2-10也不具备创造性。
复审请求人于2019年07月09日提交了意见陈述书，修改了权利要求，将原权利要求2、3的技术特征增加到原权利要求1中，并将其他权利要求适应性修改。复审请求人认为：⑴根据说明书第0080和0083段，本申请解决的技术问题是提高肿瘤干细胞对化疗药物的敏感性，而对比文件1提供的是抑制和/或治疗肿瘤的制剂。⑵0073段描述了定位肽用于定位细胞核，并非进入细胞和发生水解。⑶不同的连接肽可以改变融合蛋白与两个相应受体之间的亲和力，有可能会影响功能蛋白功能特性。
新修改的权利要求如下:
“1. 一种具有肿瘤抑制作用的真核重组蛋白，其特征在于，将能与β-catenin结合的转录因子TCF4的氨基端(N端)的80个氨基酸序列命名为N240，在N240的N端连接核定位肽NLS，在N240的C端连接穿膜信号肽TAT，在NLS和N240之间加入His-FLAG标签，所述具有肿瘤抑制作用的真核重组蛋白功能区代号为：NLS-His-FLAG-N240-TAT；
所述具有肿瘤抑制作用的真核重组蛋白全长132个氨基酸，其中1～25为NLS序列，26～39为His-FLAG标签序列，42～121为N240序列，122～132为TAT序列，所述His-FLAG标签序列与所述N240序列之间用RS两个氨基酸进行连接；
所述具有肿瘤抑制作用的真核重组蛋白的氨基酸序列为：
所述具有肿瘤抑制作用的真核重组蛋白对应的碱基序列为：
所述的具有肿瘤抑制作用的真核重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括：
(1)NLS-His-FLAG-N240-TAT基因的克隆
以pcDNA/Myc-TCF4载体为模板用高保真PCR扩增试剂盒扩增含TCF4前80个氨基酸的N240序列，在上下游引物中分别引入His-Flag序列和TAT序列，在N端引入NLS序列，得到初级PCR产物，以所述初级PCR产物为模板扩增最终的NLS-His-FLAG-N240-TAT序列，而后在最终的NLS-His-FLAG-N240-TAT 序列两端分别引入内切酶Hind III和Kpn I酶切位点，得到PCR产物，
用所述内切酶Hind III和Kpn I酶切所述PCR产物，再用胶回收试剂盒回收，得到PCR酶切产物；
用所述内切酶Hind III和Kpn I酶切所述PCR产物，经1％琼脂糖凝胶电泳后用质粒抽提试剂盒回收，得到质粒酶切产物pcDNA3.1质粒；
在温度为3～5℃的环境下采用T4DNA连接酶将所述PCR酶切产物和所述质粒酶切产物pcDNA3.1质粒连接过夜，而后转化至E.coli Dh5α感受态细胞后涂布到含50μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上，在温度为36～38℃的环境下培养过夜；
挑取单菌落，LB固体培养基过夜培养后通过PCR初筛阳性克隆、质粒抽提试剂盒抽提，得到阳性质粒：pcDNA3.1-NLS-His-FLAG-N240-TAT；
(2)HEK293细胞的转染与表达
将pcDNA3.1-NLS-His-FLAG-N240-TAT通过脂质体转染试剂转染HEK293细胞48小时后，加入新霉素进行加压筛选，构建表达NLS-His-FLAG-N240-TAT基因的HEK293稳转细胞株；
(3)NLS-His-FLAG-N240-TAT重组蛋白的分离纯化
对所述HEK293稳转细胞株进行扩大培养，而后收集细胞并抽提细胞总蛋白，蛋白抽提液用0.45μm的滤器过滤，使用Ni柱纯化带有His标签的重组蛋白；
具体过程如下：转移树脂到Ni柱，待完全沉淀后，用双蒸水洗涤镍亲和层析柱，并防止下一步Ni2 沉淀；用ddH2O洗涤，除尽基质中的空气；10×柱体积的Binding buffer平衡；上样；10×柱体积的Binding buffer洗涤，收集流出液；Elution buffer洗脱，进一步超滤浓缩后得到所述具有肿瘤抑制作用的真核重组蛋白。
2. 如权利要求1所述的具有肿瘤抑制作用的真核重组蛋白，其特征在于，所述内切酶Hind III酶切位点对应的碱基序列为：AAGCTT。
3. 如权利要求1所述的具有肿瘤抑制作用的真核重组蛋白，其特征在于，所述内切酶Kpn I酶切位点对应的碱基序列为：GGTACC。
4. 如权利要求1所述的具有肿瘤抑制作用的真核重组蛋白，其特征在于，步骤(1)中，在温度为4℃的环境下采用T4DNA连接酶将所述PCR酶切产物和所述质粒酶切产物pcDNA3.1质粒连接过夜。
5. 如权利要求1所述的具有肿瘤抑制作用的真核重组蛋白，其特征在于，步 骤(1)中，在温度为37℃的环境下培养过夜。
6. 如权利要求1所述的具有肿瘤抑制作用的真核重组蛋白，其特征在于，步骤(1)中，在得到阳性质粒：pcDNA3.1-NLS-His-FLAG-N240-TAT后，对所述阳性质粒进行测序，以验证基因克隆的正确性。
7. 如权利要求1所述的具有肿瘤抑制作用的真核重组蛋白，其特征在于，步骤(2)中，在构建表达NLS-His-FLAG-N240-TAT基因的HEK293稳转细胞株后，还通过Western blot检测NLS-His-FLAG-N240-TAT蛋白的表达。
8. 如权利要求1所述的具有肿瘤抑制作用的真核重组蛋白，其特征在于，所述制备方法还包括：将所述具有肿瘤抑制作用的真核重组蛋白经SDS-PAGE电泳、转膜后，通过His单抗对所述具有肿瘤抑制作用的真核重组蛋白进行鉴定。”
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
1、审查文本的认定
复审请求人于2019年07月09日答复复审通知书时，对权利要求进行了修改，经审查，所作修改符合专利法第33条和专利法实施细则第61条第1款的规定。因此，本决定所针对的文本为：申请日2016年06月15日提交的说明书摘要、说明书第1-86段，2016年08月03日提交的说明书附图图1-图8、说明书核苷酸和氨基酸序列表，2019年07月09日提交的权利要求第1-8项。
2、关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。
在判断创造性时，首先要将权利要求所要求保护的技术方案与最接近的现有技术相比较，确定区别技术特征和发明实际解决的技术问题，进而考察现有技术中是否存在将该区别技术特征引入到所述最接近的现有技术中以解决上述技术问题的启示，如果存在这样的启示，则该权利要求不具备创造性。
权利要求1请求保护一种重组蛋白，权利要求1虽然限定了该重组蛋白的制备方法，权利要求1实质上保护的具有所示132个氨基酸构成的蛋白质，其中1～25为NLS序列，26～39为His-FLAG标签序列，42～121为N240序列，122～132为TAT序列，所述His-FLAG标签序列与所述N240序列之间用RS两个氨基酸进行连接。
对比文件1公开了一种能抑制乳腺癌细胞生长的TAT-NLS-BLBD-6融合肽，具体公开了，合成了β-catenin/LEF-1结合结构域（BLBD），转录反式激活因子（TAT，YGRKKRRQRRR）和核定位信号肽（NLS，RKRRK）的短肽以制备融合肽。BLBD肽衍生自LEF-1的前76个氨基酸，其足以与β-catenin相互结合。TAT是从人类免疫缺陷病毒得到的细胞穿膜肽，它可以在短时间内高效的将蛋白质、DNA、RNA以及纳米颗粒递送进入细胞质。然而，由于稳定的β-catenin需要易位到核内以影响TCF-4/LEF-1与Wnt目标基因的结合，因而合成了衍生自LEF-1的TAT-NLS融合肽，以分析其在乳腺癌细胞核内对β-catenin介导的信号转导的影响，并发现融合肽TAT-NLS-BLBD-6以时间和剂量依赖的方式抑制乳腺癌细胞的生长。研究发现细胞穿膜五肽TAT-NLS-BLBD-6阻止β-catenin和LEF-1之间的反应，也有效减少体内和体外肿瘤发生。这些结果表明TAT-NLS-BLBD-6是有效的Wnt信号传导抑制剂，可能是人乳腺癌的潜在治疗剂（参见第2页第2段、第9页第6段，图1a、1b）。
权利要求1和对比文件1的区别为：⑴权利要求1中与β-catenin结合的序列为N240（TCF的N端前80个氨基酸），对比文件1中与β-catenin结合的序列为BLBD（即LEF-1中与β-catenin结合的片段）；⑵权利要求1还包含His-FLAG标签、连接肽RS，以及各片段连接顺序不同。
说明书第0007、0037和0084段声称本申请的重组蛋白克服了小分子药物不能阻断TCF4与除β-catenin的其他癌基因的结合，从而有效抑制肿瘤干细胞，促进化疗药物的敏感。但根据说明书的记载，实施例1记载了重组蛋白的制备过程，实施例2记载了重组蛋白可以定位细胞核，实施例3记载了重组蛋白可以抑制c-Myc表达，实施例4记载了重组蛋白和TMZ联合使用胶质瘤干细胞的毒性比单独使用TMZ增强，实施例5记载了重组蛋白与TMZ联用比单独使用其中一种使荷瘤裸鼠的生存期更长。本申请说明书没有记载实验验证重组蛋白是否阻断了TCF4与其他癌基因结合，不能证实0007、0037和0084段声称的阻断TCF4与除β-catenin的其他癌基因结合。
因此，根据说明书记载的内容和区别技术特征，本申请实际解决的技术问题是：提供了一种效果类似的结合β-catenin的重组蛋白。
对于区别⑴，对比文件2公开了β-catenin是在胚胎发生早期控制细胞命运的Wnt信号通路的关键组分，激活该途径导致游离β-catenin的稳定化、易位到细胞核，以及与LEF-1/TCF家族转录因子的结合。β-catenin与这些因子反应并将其转变成转录激活因子，刺激启动子中包括TCF-4应答序列的一系列基因的表达。以及，TCF 4的β-catenin结合结构域（TCF-4（1-80））能够与β-catenin结合（参见摘要第3段，第2页第2段β-连环蛋白结合分析，图2），即，对比文件2给出了TCF4蛋白的氨基端80个氨基酸是能与β-catenin结合的结合结构域以及Wnt信号通路中β-连环蛋白与LEF-1/TCF结合后能够激活下游反应的技术启示，在此基础上，本领域技术人员能够想到以TCF4的β-catenin结合结构域（即氨基端的80个氨基酸）代替LEF-1的β-catenin结合结构域（即BLBD），从而与TAT和NLS制备成融合肽，也可以达到阻止β-catenin/ TCF-4/LEF-1复合体形成和抑制癌细胞生长的作用。同时，对比文件3公开了一种人源TCF-4的氨基酸序列，其中的第1-80位氨基酸与权利要求1中N240的氨基酸序列仅相差1个氨基酸，具有98％以上的序列同一性。在此基础上，本领域技术人员能够通过常规技术手段获得与之序列结构高度相似且功能相同的TCF-4结合结构域。
对于区别⑵，为了后续纯化步骤，增加组氨酸标签是本领域技术人员的常用技术（参见公知常识《基因工程原理》，阮红等编著，浙江大学出版社，2007年09月第一次印刷，第168页）。类似的，使用连接肽连接两段氨基酸序列，可使两侧的序列各自正确地折叠，从而产生正确的生物学结构和空间构象，发挥各自的生物学效能属于本领域的普通技术知识，对比文件4公开了融合肽中连接两段氨基酸序列的接头可以为‘RS’（参见对比文件4说明书第0207段）。本领域技术人员知晓，核定位肽NLS、穿膜信号肽TAT、纯化标签His-FLAG与其他功能蛋白制备融合肽时，连接在功能蛋白的上游或下游，均能够发挥其功能效果，因而，具体的连接方式是本领域技术人员通过常规技术手段可以选择确定的。
因此，在对比文件1的基础上结合对比文件2-4以及本领域常规技术手段获得权利要求1要求保护的技术方案对本领域技术人员来说是显而易见的，权利要求1要求保护的技术方案不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求2-8进一步限定了制备步骤中的酶切位点、连接温度和检测鉴定步骤，酶切参数和连接温度是本领域技术人员可以根据需要确定的，而检测鉴定步骤是在制备过程中本领域技术人员通常会采取的常规步骤，并且经过上述限定后，权利要求2-8要求保护的仍然是具有权利要求所示氨基酸序列的蛋白质。因此，在权利要求1不具备创造性的基础上，权利要求2-8请求保护的技术方案对本领域技术人员来说是显而易见的，而且其能够制备获得相应的重组蛋白的技术效果也是可以预期的，权利要求2-8不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
3、对复审请求人相关意见的评述
合议组认为，⑴本申请实施例4和5虽然在0080和0083段声称NLS-N240重组蛋白促进TMZ的敏感性，但实施例4和实施例5仅仅证实了重组蛋白和TMZ联合使用后比单独使用TMZ效果增强，由上文可知NLS-N240重组蛋白本身就具有抑制肿瘤的作用，施用两种肿瘤药物比单独使用一种的效果好，是本领域技术人员可以预期的，并不能证明重组蛋白增加了TMZ的敏感性。⑵对比文件1已经公开了完全相同的定位肽NLS，与本申请的作用相同，都是用于重组蛋白定位，该特征已经被公开，不是区别。对于信号肽、定位肽和结合肽的连接顺序，本申请和证据1中定位肽均位于结合肽的N端（之间有His标签），不同点为本申请中信号肽位于结合肽的C端，而证据1中信号肽与定位肽相连，但是具体的连接方式是本领域技术人员通过常规技术手段可以选择确定的,本领域技术人员可以尝试不同的连接顺序，实验得到具有各片段功能的重组蛋白。⑶用连接肽连接不同功能域是本领域的常规技术手段，本案中两个氨基酸的连接肽RS已经是现有技术（参见对比文件4说明书第0207段），因此在公知常识一般规律（参见公知常识《基因工程原理》，阮红等编著，浙江大学出版社，2007年09月第一次印刷，第197-198页）和研发情况（参见对比文件4出处同前）的教导下本领域技术人员容易想到使用RS。复审请求人所称的连接肽所带来的差异，并不会使本领域技术人员失去动机，依据已知规律和研究情况采用常用的连接肽。本申请并没有试验证明所采用RS两个氨基酸的连接肽带来了区别于其他连接肽的预料不到的技术效果。综上，复审请求人的意见不成立。
三、决定
维持国家知识产权局于2018年02月13 日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
郑重声明：本文版权归原作者所有，转载文章仅为传播更多信息之目的，如作者信息标记有误，请第一时间联系我们修改或删除，多谢。
