发明创造名称：核酸的检测方法及核酸检测试剂盒
外观设计名称：
决定号：187797
决定日：2019-08-23
委内编号：1F242535
优先权日：2012-06-20
申请（专利）号：201380023524.6
申请日：2013-06-19
复审请求人：东丽株式会社
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：李娟娟
合议组组长：彭郁葱
参审员：王慧
国际分类号：C12Q1/68，C12N15/09
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：评价一项发明的创造性时，应将其与最接近的现有技术比较以确定区别技术特征，然后考察现有技术从整体上是否给出了将上述区别应用到该最接近的现有技术以获得该发明技术方案的启示。如果现有技术中存在这种启示，并且所获得的发明的技术效果是可以预料的，则该发明不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201380023524.6，名称为“核酸的检测方法及核酸检测试剂盒”的发明专利申请（下称本申请）。申请人为东丽株式会社。本申请的申请日为2013年06月19日，优先权日为2012年06月20日，公开日为2015年01月07日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年10月11日以权利要求1-5不具备专利法第22条第2款规定的新颖性以及权利要求1-8不具备专利法第22条第3款规定的创造性为由，驳回了本发明专利申请。驳回决定所依据的文本为：2014年11月04日本申请进入中国国家阶段时提交的国际申请文件中文译文的说明书第1-17页、说明书摘要、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-2页，2016年10月28日提交的权利要求第1-8项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种靶核酸的检测方法，所述方法包括以下工序：
使捕获探针与靶核酸杂交、形成双链核酸的工序；
使所形成的双链核酸与含有标记物及下述二价金属阳离子的溶液接触、将该标记物导入该双链核酸中的工序，所述二价金属阳离子为浓度10mM以上的镁离子或浓度100mM以上的锌离子、锰离子或钙离子；和
对被导入至所述双链核酸中的所述标记物进行检测的工序。
2. 如权利要求1所述的方法，其中，所述捕获探针被固定化于支持体上。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其中，所述标记物为荧光物质。
4. 如权利要求1或2所述的方法，其中，所述标记物向所述靶核酸中的导入利用亲和素-生物素相互作用来进行。
5. 如权利要求4所述的方法，其中，所述靶核酸已被生物素化，所述标记物的导入通过使标记亲和素或标记链亲和素与所述靶核酸上的生物素相互作用来进行。
6. 如权利要求1或2所述的方法，其中，标记物向所述靶核酸中的导入如下进行：使将与所述杂交得到的双链核酸发生抗原抗体反应的经标记的抗体或其抗原结合性片段与所述双链核酸发生抗原抗体反应。
7. 如权利要求1或2所述的方法，其中，在使所述捕获探针与所述靶核酸杂交的工序中，所述捕获探针处于未被固定在支持体上的游离状态，将所述捕获探针与所述靶核酸杂交得到的双链核酸固定化于支持体上。
8. 如权利要求7所述的方法，其中，所述双链核酸向所述支持体上的固定化如下进行：使将与该双链核酸发生抗原抗体反应的、被固定化于支持体上的抗体或其抗原结合性片段与所述双链核酸发生抗原抗体反应。”
驳回决定指出：对比文件5（CN1697881A，公开日2005年11月16日）公开了权利要求1-5中涉及“浓度10mM以上的镁离子”的技术方案，因此，相应技术方案不具备新颖性。对比文件6（“Shielding effect of monovalent and divalent cations on solid-phase DNA hybridization: surface plasmon resonance biosensor study”，Tomas Springer等，Nucleic Acids Research，第38卷第20期，第7343-7351页，2010年07月12日）教导了对于固相杂交而言，二价阳离子Mg2 对于杂交稳定性的作用比单价阳离子Na 的作用强得多，使用15mM Mg2 就能获得比使用1M Na 更好的稳定作用，并且解释了其原因，本领域技术人员根据对比文件6的教导容易获知，除了镁离子，还可以使用其它二价阳离子，例如锌离子、锰离子或钙离子，其在参考镁离子的浓度的基础上，通过有限的实验容易确定锌离子、锰离子或钙离子的适宜浓度，并能够合理预期它们同样能够获得比使用单价阳离子更强的稳定杂交的双链的效果。因此，权利要求1涉及“浓度10mM以上的镁离子”之外的技术方案不具备创造性。权利要求2-8的附加技术特征或者被对比文件5公开，或者为本领域的常规技术，因此，相关技术方案也不具备创造性。
申请人东丽株式会社（下称复审请求人）对上述驳回决定不服,于2018年01月15日向国家知识产权局提出了复审请求，同时提交了权利要求书全文替换页(共1页8项)，相对于驳回决定所针对的权利要求书，修改之处在于：将权利要求1所述的“所述二价金属阳离子为浓度10mM以上的镁离子或浓度100mM以上的锌离子、锰离子或钙离子”修改为“所述二价金属阳离子为浓度100mM以上的镁离子、锌离子、锰离子或钙离子”。复审请求人认为：向靶核酸中导入标记物的方法分为两大类，一是在靶核酸与捕获探针杂交前就向靶核酸中导入标记物，另一是本发明所涉及的后染法，也就是在杂交后再向靶核酸中导入标记物。现有的后染法存在如下问题：在将标记物导入靶核酸中时或在清洗除去未被导入靶核酸中的标记物时，杂交至捕获探针上的靶核酸脱落，结果导致检测信号减弱。为了抑制靶核酸的脱落，通常采用在标记液中含有高浓度钠离子的技术手段。而发明人发现，在杂交至捕获探针上的靶核酸的标记化工序中使用含有二价金属阳离子的溶液时，与使用钠离子的情况相比能够以更低浓度抑制同等以上的靶核酸脱落、获得同等程度以上的检测信号（参见实施例，表2和表5）。此外，本领域已知二价金属阳离子是能够活化各种核酸酶的物质，本领域技术人员在利用杂交检测核酸时会避免使用二价金属阳离子。本发明则利用二价金属阳离子，实现了预料不到的技术效果。对比文件5实施例5的捕获序列处于微珠上，由于采用了微珠及其检测系统，因而无需对未导入的标记物清洗和除去，其不涉及本发明要解决的技术问题，其采用含有50mM Mg2 的缓冲液是为了与之前的杂交反应体系保持一致的离子浓度。对比文件6中仅对用于固相杂交的缓冲液进行了讨论，其同样也不涉及后染法中存在的特定技术问题。因此，对比文件5、6对于本发明的发明构思没有教导或暗示。另外，如本申请说明书表2中所示，当镁离子浓度为100mM时，信号强度是50mM时（即对比文件5实施例5所用浓度）的1.2倍之高。即，对比文件5无法实现本发明的技术效果。而且，现有技术也没有教导通过提高镁离子浓度来提高检测信号强度及测定灵敏度。因此，本发明具备创造性。
复审请求时新修改的权利要求1如下：
“1. 一种靶核酸的检测方法，所述方法包括以下工序：
使捕获探针与靶核酸杂交、形成双链核酸的工序；
使所形成的双链核酸与含有标记物及下述二价金属阳离子的溶液接触、将该标记物导入该双链核酸中的工序，所述二价金属阳离子为浓度100mM以上的镁离子、锌离子、锰离子或钙离子；和
对被导入至所述双链核酸中的所述标记物进行检测的工序。”
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年01月23日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年04月28日向复审请求人发出复审通知书，指出：权利要求1与对比文件5的区别在于：限定了使用浓度100mM以上的镁离子、锌离子、锰离子或钙离子。对比文件6教导了对于DNA固相杂交而言，二价阳离子Mg2 对于杂交稳定性的作用比单价阳离子Na 的作用强得多，使用15mM Mg2 就能获得比使用1M Na 更好的稳定作用，并且解释了其原因。对于本领域技术人员而言，在使用捕获序列来检测靶序列的过程当中，稳定杂交结构，减少假阴性的存在，是本领域的普遍需求，因此，本领域技术人员根据对比文件6的教导容易获知，为了提高杂交的稳定性，提高检测的准确度，其有动机使用镁离子来代替钠离子，根据对比文件6所公开的镁离子稳定杂交作用的原因，也有动机使用其它二价阳离子，例如锌离子、锰离子或钙离子来代替单价阳离子Na ，且能够通过有限的实验确定使用镁离子、锌离子、锰离子或钙离子来稳定杂交结构的适宜浓度，并能够合理预期它们同样能够获得比使用单价阳离子更强的稳定杂交的双链的效果。因此，权利要求1不具备创造性。权利要求2-8的附加技术特征或者被对比文件5公开，或者属于常规技术，因此，也不具备创造性。
复审请求人于2019年06月12日提交了意见陈述书，并提交了权利要求书全文替换页（共2页8项），相对于复审通知书所针对的权利要求，修改之处在于：在权利要求1中补入“将未被导入双链核酸中的标记物清洗并除去的工序”。复审请求人认为：本申请在工序(2)中采用包含标记物及浓度为100mM以上的镁离子、锌离子、锰离子或钙离子的溶液，从而解决了“在将标记物导入靶核酸中时、或在清洗除去未被导入靶核酸中的标记物时，杂交至捕获探针上的靶核酸脱落，其结果导致检测信号减弱”这样的特定技术问题。对比文件6仅涉及核酸杂交，不涉及标记物向靶核酸的导入，因此，没有动机在工序（2）中采用包含标记物及浓度为100nM以上镁离子等溶液。对比文件5没有公开清洗去除未导入标记物的工序，其向含有双链核酸的杂交反应体系中添加镁离子缓冲液的目的只不过是为了与之前的杂交反应体系保持一致的离子浓度；且鉴于对比文件5采用微珠及检测系统，无需进行标记物清洗和去除工序，因此，不涉及本申请所要解决的技术问题。
修改的权利要求1如下：
“1. 一种靶核酸的检测方法，所述方法包括以下工序：
使捕获探针与靶核酸杂交、形成双链核酸的工序；
使所形成的双链核酸与含有标记物及下述二价金属阳离子的溶液接触、将该标记物导入该双链核酸中的工序，所述二价金属阳离子为浓度100mM以上的镁离子、锌离子、锰离子或钙离子；
将未被导入双链核酸中的标记物清洗并除去的工序；和
对被导入至所述双链核酸中的所述标记物进行检测的工序。”
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审请求人在答复复审通知书时，提交了权利要求书全文替换页(共2页8项)。经审查，其修改符合专利法第33条和专利法实施细则第61条第1款的规定。本复审决定所针对的文本为：2014年11月04日本申请进入中国国家阶段时提交的国际申请文件中文译文的说明书第1-17页、说明书摘要、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-2页，2019年06月12日提交的权利要求第1-8项。
有关专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明有突出的实质性特点和显著的进步。
根据该款的规定，评价一项发明的创造性时，应将其与最接近的现有技术比较以确定区别技术特征，然后考察现有技术从整体上是否给出了将上述区别应用到该最接近的现有技术以获得该发明技术方案的启示。如果现有技术中存在这种启示，并且所获得的发明的技术效果是可以预料的，则该发明不具备创造性。
本案中，权利要求1请求保护“一种靶核酸的检测方法，所述方法包括以下工序：使捕获探针与靶核酸杂交、形成双链核酸的工序；使所形成的双链核酸与含有标记物及下述二价金属阳离子的溶液接触、将该标记物导入该双链核酸中的工序，所述二价金属阳离子为浓度100mM以上的镁离子、锌离子、锰离子或钙离子；将未被导入双链核酸中的标记物清洗并除去的工序；和对被导入至所述双链核酸中的所述标记物进行检测的工序。”
对比文件5公开了一种使用非标准碱基的固相支持体分析系统和方法，并具体公开了以下内容：9个多态性座位上的基因型通过以下步骤确定：扩增，查询和捕获来自基因组DNA样品中的靶核酸序列。第一步是一个多重PCR反应……。第二步是一个多重的等位基因特异引物延伸(ASPE)反应，包括多组已标记的等位基因特异引物……。标记的三磷酸(dATP-生物素)被加入ASPE反应物中，从而标记等位基因特异性引物的等位基因特异性延伸导致了dATP-生物素的掺入。未掺入的dATP-生物素在随后的捕获步骤之前被去除。第三步，即多重ASPE反应产物的捕获，使用了包含有与特定LuminexTM微珠共价结合的非标准核苷酸(iso-C)的捕获序列（相当于捕获探针）。捕获序列与前面 ASPE反应使用的标记等位基因特异性引物上的标记序列互补。加入藻红素 (Phycoerythrin)是为了在标记等位基因特异引物链的延伸物上结合生物素标记，从而提供一种荧光信号。在捕获序列和标记序列杂交后，微珠被注入Luminex100TM装置，以检测与每组特定微珠身份相关的信号。……以上列出的组分是在反应溶液终体积为60μL的反应体系中，母混合液的浓度为1.2倍。50μL的母溶液与10μl纯化的多重ASPE反应溶液混合，在室温条件下杂交十分钟。10μl含有0.01mg/ml的链霉抗生物素蛋白藻红素 (Phycoerethrin)(Molecular Probes，Eugene，OR)的杂交缓冲液(10mM MOPS pH7.5，200mM NaCl，50mM MgCl2，1mM EDTA，1％PEG8000，0.05％SDS)被加入到每一种捕获杂交反应液中，然后注射到Luminex100TM仪中（参见对比文件5实施例5）。即，对比文件5公开了一种靶核酸的检测方法，所述方法包括以下工序：使捕获探针与靶核酸杂交、形成双链核酸的工序；使所形成的双链核酸与含有标记物链霉抗生物素蛋白藻红素及浓度为50mM的镁离子、200mM 钠离子的溶液接触、将该标记物导入该双链核酸中的工序；和对被导入至所述双链核酸中的所述标记物进行检测的工序。由此可见，该权利要求1与对比文件5的区别在于：权利要求1限定了使用浓度100mM以上的镁离子、锌离子、锰离子或钙离子，将未被导入双链核酸中的标记物清洗并除去的工序。基于上述区别技术特征可以确定权利要求1实际解决的技术问题是：提供一定浓度的稳定核酸杂交结构的阳离子替代物。对比文件6公开了DNA杂交过程受到阳离子屏蔽作用的重要影响，并且固相杂交中带负电荷的探针的表面密度很高，因而这种作用对于固相杂交和液相杂交的影响非常不同；研究发现二价的镁离子比单价的钠离子对于稳定双链的效率高得多（缓冲液中15mM Mg2 比1M Na 导致高得多的杂交）；空间压力限制了阳离子完全屏蔽脱氧磷酸核糖骨架上的负电荷，这也许可以解释与溶液中低浓度的寡核苷酸相比，高度压缩的双链的稳定性降低；业已表明，在分离的DNA双链周围分布的镁离子较之钠离子更为紧凑，因此，在有限的空间条件下，镁离子的正电荷总量更高；这可以解释为何对于固相杂交而言，镁离子比钠离子具有更强的稳定作用，以及钠-镁竞争是更为重要的（参见对比文件6摘要、第7348页右栏最后1段至第7349页左栏第1段、第7350页左栏最后1段）。即，对比文件6教导了对于DNA固相杂交而言，二价阳离子Mg2 对于杂交稳定性的作用比单价阳离子Na 的作用强得多，使用15mM Mg2 就能获得比使用1M Na 更好的稳定作用，并且解释了其原因。对于本领域技术人员而言，在使用捕获序列来检测靶序列的过程当中，稳定杂交结构，减少假阴性的存在，是本领域的普遍需求，因此，本领域技术人员根据对比文件6的教导容易获知，为了提高杂交的稳定性，提高检测的准确度，其有动机使用镁离子来代替钠离子，根据对比文件6所公开的镁离子稳定杂交作用的原因，也有动机使用其它二价阳离子，例如锌离子、锰离子或钙离子来代替单价阳离子Na ，且能够通过有限的实验确定使用镁离子、锌离子、锰离子或钙离子来稳定杂交结构的适宜浓度，并能够合理预期它们同样能够获得比使用单价阳离子更强的稳定杂交的双链的效果。此外，对比文件5使用微珠以及Luminex装置来实现核酸的检测，该技术无需对未结合的标记物进行清洗，便可以实现准确检测。然而，对于本领域技术人员而言，本领域存在多种通过杂交以及标记手段来检测核酸的常规方法，在这些常规方法中，为了提高检测的准确性，在检测之前，将未结合的标记物进行清洗去除，属于本领域的一种常规操作，其与对比文件5所述的方法均能够实现对目的核酸的良好检测，均属于本领域的常规检测手段。因此，在对比文件5的基础上结合对比文件6以及常规技术以获得权利要求1请求保护的上述技术方案，对于本领域技术人员而言是显而易见的，权利要求1的上述技术方案不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求2进一步限定捕获探针被固定化于支持体上。对比文件5公开了所述捕获探针被固定化于固相支持体LuminexTM微球上（参见对比文件5说明书实施例5标题、第39页倒数第2段）。因此，权利要求2也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求3-6进一步限定所述标记物为荧光物质；标记物向所述靶核酸中的导入利用亲和素-生物素相互作用来进行；所述靶核酸已被生物素化，标记物的导入通过使标记亲和素或标记链亲和素与所述靶核酸上的生物素相互作用来进行；标记物向所述靶核酸中的导入如下进行：使将与所述杂交得到的双链核酸发生抗原抗体反应的经标记的抗体或其抗原结合性片段与所述双链核酸发生抗原抗体反应。对比文件5还公开了以下内容：标记的三磷酸(dATP-生物素)被加入ASPE反应物中，从而标记等位基因特异性引物的等位基因特异性延伸导致了dATP-生物素的掺入。未掺入的dATP-生物素在随后的捕获步骤之前被去除。第三步，即多重ASPE反应产物的捕获，使用了包含有与特定Lumi nexTM微珠共价结合的非标准核苷酸(iso-C)的捕获序列。捕获序列与前面 ASPE反应使用的标记等位基因特异性引物上的标记序列互补。加入藻红素 (Phycoerythrin)（链霉抗生物素蛋白藻红素）是为了在标记等位基因特异引物链的延伸物上结合生物素标记，从而提供一种荧光信号（参见对比文件5说明书第39页倒数第2-3段）。由于使用标记生物素的核酸序列和链霉抗生物素蛋白藻红素结合的方式属于一种抗原抗体反应。因此，对比文件5公开了权利要求3-6的附加技术特征，权利要求3-6也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求7-8进一步限定在使所述捕获探针与所述靶核酸杂交的工序中，所述捕获探针处于未被固定在支持体上的游离状态，将所述捕获探针与所述靶核酸杂交得到的双链核酸固定化于支持体上；所述双链核酸向所述支持体上的固定化如下进行：使将与该双链核酸发生抗原抗体反应的、被固定化于支持体上的抗体或其抗原结合性片段与所述双链核酸发生抗原抗体反应。对于本领域技术人员而言，除了对比文件1公开的先将探针固定在支持体上，然后再与靶核酸进行杂交以外，先使未被固定在支持体上的游离状态的探针与靶核酸杂交，然后再将杂交得到的双链核酸固定化于支持体上也是本领域的常用技术手段；对比文件5还公开了支持体可以部分或全部被结合试剂所包被，比如，抗生蛋白链菌素，抗体，抗原，酶，酶的辅助因子或抑制因子，激素，或激素受体。结合试剂通常是生物分子或合成分子，它们通过共价键或非共价键对其它分子或大分子具有高的亲和力。捕获寡聚核苷酸偶联于结合试剂互补体（如，生物素，抗原，抗体，酶的辅助因子或抑制因子，酶，激素受体，或激素）。当捕获寡聚核苷酸在与结合试剂接触时，捕获寡聚核苷酸将被保留在支持体上（参见对比文件5说明书第12页第4段）。在对比文件5公开了以上固定核酸的方式下，本领域技术人员容易想到使将与该双链核酸发生抗原抗体反应的、被固定化于支持体上的抗体或其抗原结合性片段与所述双链核酸发生抗原抗体反应，从而使双链核酸固定化于支持体上。因此，权利要求7-8也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
对复审请求人相关意见的评述
针对复审请求人的意见陈述，合议组认为：首先，如前所述，对比文件5使用微珠以及Luminex装置来实现核酸的检测，该技术无需对未结合的标记物进行清洗，便可以实现准确检测，然而，本领域存在多种通过杂交以及标记手段来检测核酸的常规方法，在这些常规方法中，为了提高检测的准确性，在检测之前，将未结合的标记物进行清洗去除，属于本领域的一种常规操作，其与对比文件5所述的方法均能够实现对目的核酸的良好检测，均属于本领域的常规检测手段。其次，在对杂交核酸进行检测的过程中，从杂交结构形成的开始一直到检测结果的出现之前，稳定杂交结构从始至终都是需要关注的焦点，即无论是在形成杂交结构的反应中，还是在添加标记物的过程中，以及在必要的时候采用的清洗过程中，都需要考虑提高杂交结构的稳定性。再者，对比文件5明确公开了链霉抗生物素蛋白藻红素的杂交缓冲液包括10mM MOPS pH7.5，200mM NaCl，50mM MgCl2，1mM EDTA，1％PEG8000，0.05％SDS（参见对比文件5实施例5），即公开了该标记过程中添加了一定浓度的Na离子等稳定核酸杂交结构的物质；对比文件6教导了对于DNA固相杂交而言，二价阳离子Mg2 对于杂交稳定性的作用比单价阳离子Na 的作用强得多，使用15mM Mg2 就能获得比使用1M Na 更好的稳定作用，并且解释了其原因。在此教导下，本领域技术人员有动机使用镁离子来稳定对比文件1所述方法中的核酸杂交结构，也有动机在对比文件1中链霉抗生物素蛋白藻红素的杂交缓冲液中添加合适量的镁离子或代替其中的钠离子来实现杂交结构的稳定性。由此可见，复审请求人的意见陈述不具备说服力。
基于以上事实和理由，合议组作出如下审查决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2017年10月11日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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