发明创造名称：一种有核细胞体外分离试剂盒及其应用方法
外观设计名称：
决定号：15607
决定日：2010-11-10
委内编号：4W100271
优先权日：
申请（专利）号：200610106875.5
申请日：2006-08-07
复审请求人：
无效请求人：刘东涛
授权公告日：2009-05-06
审定公告日：
专利权人：宁夏中联达生物有限公司
主审员：
合议组组长：尹昕
参审员：孙俊荣
国际分类号：C12N 5/08
外观设计分类号：
法律依据：?专利法第22条第3款;专利法第26条第3款??
决定要点：?当一项发明专利权利要求保护的技术方案与请求人提供的最接近的现有技术相比存在区别特征时，如果请求人提供的同一份对比文件的其它部分或其它对比文件均未给出将该区别技术特征应用到最接近的现有技术中以解决发明实际要解决的技术问题的启示，而且引入了所述区别特征的该权利要求的技术方案产生了有益的技术效果，则该权利要求相对于请求人提供的证据而言具备创造性。如果所属技术领域的技术人员按照说明书记载的内容，就能够实现该发明的技术方案，解决其技术问题，并且产生预期的技术效果，则说明书对该发明作出了清楚、完整的说明。
全文：
一、案由
本专利权无效宣告请求案涉及国家知识产权局于2009年05月06日公告授予的、名称为“一种有核细胞体外分离试剂盒及其应用方法”的第200610106875.5号发明专利权（下称本专利），其申请日为2006年08月07日，专利权人为宁夏中联达生物有限公司。本专利授权公告时的权利要求书如下：
“1. 一种有核细胞体外分离试剂盒，其特征在于该试剂盒中包含有红细胞沉淀剂、细胞保养液和泛影酸钠-聚蔗糖400#或HISTOPAQUE1077，各试剂溶液分开保存，上述红细胞沉淀剂是指由0.4％～1.2％的羟乙基淀粉与0.2％～0.4％葡萄糖酸钙组成的水溶液，或0.4％～1.2％的羧甲基淀粉与0.2％～0.4％葡萄糖酸钙组成的水溶液，或0.4％～1.2％的甲基纤维素与0.2％～0.4％葡萄糖酸钙组成的水溶液，上述水溶液PH为7～8。
2. 按照权利要求1所述的有核细胞体外分离试剂盒，其特征是：所泛影酸钠-聚蔗糖400#由0.3％～1.5％泛影酸钠和8％的聚蔗糖400#组成的水溶液，该水溶液PH值为7～8。
3. 按照权利要求1所述的有核细胞体外分离试剂盒，其特征是：所述细胞保养液为磷酸缓冲液或生理盐水。
4. 一种如权利要求1所述的有核细胞体外分离试剂盒的应用方法，其工艺过程为：首先用细胞保养液将骨髓或脐带血稀释，然后与红细胞沉淀剂混匀，静置8～20分钟后收取上清液，离心浓缩，浓缩液再加入泛影酸钠-聚蔗糖400#或HISTOPAQUE1077后离心分离20～30分钟，吸取有核细胞层，用细胞保养液清洗1～4次即可。”
针对上述专利权，刘东涛（下称请求人）于2010年05月10日向专利复审委员会提出了无效宣告请求（委内编号为4W100271），请求宣告本专利权利要求?1－4?无效，其理由为本专利说明书不符合专利法第26条第3款的规定，权利要求1－4不符合专利法第22条第3款的规定。请求人同时提交了本专利的授权公告文本和如下证据：
证据1：《吴祖泽院士科技文选》，军事医学科学出版社，2005年11月，封面、出版信息页以及第88－89页的“人脐血间充质干细胞体外扩增和向神经元样细胞定向诱导分化的研究”，复印件共4页；
证据2：《外周血干细胞移植》，达万明、裴雪涛主编，人民卫生出版社，2000年9月，封面、出版信息页、第304－305页，复印件共4页；
证据3：《干细胞实验指南》，裴雪涛主编，科学出版社，2006年1月，封面、出版信息页、第1－3页，复印件共5页；
证据4：《干细胞生物学》，裴雪涛主编，科学出版社，2003年7月，封面、出版信息页、编委页、第112－115页，复印件共7页；
证据5：细胞处理试剂盒使用说明书，复印件共1页；
证据6：中华人民共和国医疗器械注册证和医疗器械注册登记表，注册号：宁（银）食药监械（准）字2008第1400008号，复印件共2页。
请求人认为：（1）关于专利法第22条第3款
本专利权利要求1要求保护一种用于有核细胞体外分离的试剂盒，证据1第89页第24-27行公开了脐血MSC的体外分离、纯化和扩增培养，采用了PBS（磷酸缓冲液）稀释，5g／L的甲基纤维素沉淀，相对密度1.077的淋巴细胞分离液分层。本专利权利要求1中涉及甲基纤维素的技术方案与证据1的区别仅在于沉淀剂中还包括葡萄糖酸钙，而说明书中没有说明该试剂盒中采用葡萄糖酸钙的原理和作用，也没有说明与现有技术相比，使用葡萄糖酸钙能够解决的技术问题和效果。另外，证据5和6是专利权人生产的标注有本专利专利号的产品说明书和“医疗器械注册证”，其中均未记载葡萄糖酸钙这一组分，说明在具体实施本专利时葡萄糖酸钙并非必要组分。因此，权利要求1限定的试剂盒与证据1公开的内容相比，不具有突出的实质性特点和显著进步，不符合专利法第22条第3款的规定。
本专利权利要求4要求保护权利要求1的试剂盒的应用方法，其与证据1公开的方法的区别在于权利要求4在红细胞沉淀步骤还使用了葡萄糖酸钙，基于与权利要求1不具备创造性类似的理由，权利要求4与证据1相比，也不符合专利法第22条第3款的规定。
证据2（见第304页，第17－19行）公开了包括羟乙基淀粉法去除红细胞的多种分离脐血的方法。将证据2公开的内容与权利要求1限定的内容相比，区别在于：证据2公开的方法不需要对脐血进行稀释；证据2中使用6％羟乙基淀粉溶液沉降，权利要求1的试剂盒使用0.4％－1.2％的羟乙基淀粉与0.2％－0.4％的葡萄糖酸钙组成的水溶液沉降；证据2采用离心分离分层，权利要求1采用分层液分层。证据2的分层步骤更加简便和易于操作，虽未对脐血进行稀释，但仍然得到理想效果。而本专利说明书中没有说明同时使用羟乙基淀粉和葡萄糖酸钙沉降能够为其技术方案带来何种效果。因此，权利要求1限定的试剂盒与证据2公开的内容相比，不具有突出的实质性特点和显著进步，不符合专利法第22条第3款的规定。另外，由于羟甲基淀粉与羟乙基淀粉的结构极为相似，本领域技术人员可以根据羟乙基淀粉具有沉淀红细胞的作用，推知在实施红细胞沉淀作用的过程中，羟甲基淀粉会起到相似或相同的作用。同理，与证据2公开的内容相比，权利要求1中羟甲基淀粉和葡萄糖酸钙的技术方案同样不具有突出的实质性特点和显著进步，不符合专利法第22条第3款的规定。
本专利从属权利要求2进一步限定了权利要求1中泛影酸钠-聚蔗糖的组成和pH值，证据3（第1－3页）公开了淋巴细胞分层液聚蔗糖-泛影酸钠（ficoll-hypaque，F/H）有成品供应，在权利要求1不具备创造性的前提下，权利要求2也不符合专利法第22条第3款的规定；从属权利要求3进一步限定权利要求1细胞保养液为磷酸缓冲液或生理盐水，证据1（第89页，第24行）公开了磷酸缓冲液（PBS）作为稀释剂，作用与其在权利要求3限定的技术方案中的作用相同，在权利要求1不具有创造性的情况下，权利要求3也不具有创造性。因此，与证据1或2公开的内容相比，权利要求3限定的试剂盒不具有创造性。
（2）关于专利法第26条第3款
说明书第1页的第25行“另一是目的”语义不清楚；说明书第2页的第4行“钙水溶液PH为7-8”中概念“钙水溶液”无法实施；说明书第2页的第6行“应用方法”与“工艺过程”语义矛盾，逻辑不清；说明书第2页的第28行“以1200转／8分钟”的限定违背常理，不合规范；说明书第2页的第31行记载“用臭酚兰检测细胞存活率”，本领域普通技术人员无法判断其中的“臭酚兰”为何物；说明书第3页的第5-6行记载了“红细胞沉淀剂：1.2％的羟乙基淀粉与0.2％的葡萄糖酸钙加水溶解所得的溶解液，”，第15-16行记载了“红细胞沉淀剂：0.8％的甲基纤维素与0.3％的葡萄糖酸钙加水溶解所得的溶解液”，本领域普通技术人员依据常识和上述定义，无法得知“1.2％的羟乙基淀粉与0.2％的葡萄糖酸钙”中，除了“1.2％的羟乙基淀粉”和 “0.2％的葡萄糖酸钙”的其它组成部分；也不清楚“0.8％的甲基纤维素与0.3％的葡萄糖酸钙”中，除了“0.8％的甲基纤维素”和“0.3％的葡萄糖酸钙”的其它组成部分。因此，本领域普通技术人员依据说明书记载的内容无法实现本专利的技术方案，本专利说明书不符合专利法第26条第3款的规定。
经形式审查合格，专利复审委员会于2010年07月01日受理了上述无效宣告请求，并将无效宣告请求书及其证据副本转送给了专利权人，同时成立合议组对本案进行审查。
专利权人针对上述无效宣告请求于2010年8 月4 日提交了意见陈述书，其中指出：本专利权利要求1要求保护一种试剂盒，而证据1公开的是一种实验方法且没有公开葡萄糖酸钙的试剂。本发明解决了有核细胞分离提取规范化操作的难题，解决了临床医生分离获得有核细胞的瓶颈。因此，证据1实验研究的目的、方法、试剂与本发明有本质区别；证据2没有公开权利要求1中限定的除了羟乙基淀粉外的其他试剂，与本发明有本质区别，因此，本领域技术人员很难从证据1、2公开的内容中获得启示，开发出本专利权利要求1所要求保护的试剂盒，权利要求1具有创造性。在独立权利要求具备创造性的前提下，其从属权利要求2和3也具备创造性。本专利权利要求4的方法与证据1的方法相比，收集的细胞、分离的技术等均存在差异，而且本发明使用了葡萄糖酸钙提高了细胞的成活率。证据2中公开的红细胞沉淀剂中没有加入葡萄糖酸钙，也没有涉及细胞保养液、泛影酸钠-聚蔗糖400＃或HISTOPAQUE1077。因此权利要求4相对于证据1、2具备创造性。（2）无效请求人提出的几个问题均为专利申请过程中的疏忽，如将“苔盼蓝”写为“臭酚蓝”是笔误，本领域技术人员可以发现和自行纠正，并不影响本发明的实施。因此本专利符合专利法第26条第3款的规定。
专利法复审委员会于2010年9月1日将上述专利权人的意见陈述书转送给无效请求人。
专利复审委员会本案合议组于2010 年9 月1 日向双方当事人发出口头审理通知书，定于2010 年10 月20 日举行口头审理。
请求人针对上述专利权人的意见陈述书于2010年10月18日提交了意见陈述书，其中指出：（1）专利权人将说明书中不符合专利法第26条第3款的一系列问题定性为笔误，并认为此类错误本领域普通技术人员可自行辨别和纠正，这种主张不能成立，本专利说明书记载的技术方案是不清楚的，本领域普通技术人员依据说明书记载的内容无法实现其要求保护的技术方案，本专利说明书不符合专利法第26条第3款的规定。（2）试剂盒能够给技术人员提供操作方便是本领域普通技术人员都知道的常识，这一技术特征并不会导致本专利具备创造性。对于本专利中有关葡萄糖酸钙的技术特征，请求人认为本专利说明书实施例中并没有加入钙离子可以降低细胞死亡率的试验数据和相关对比试验，专利权人主张的技术效果仅仅是一种断言，得不到有效试验数据的支持。因此，如请求书所述，权利要求1－4与证据1和2相比不具备创造性。
口头审理如期举行，专利权人和其代理人以及请求人的代理人出席了本次口头审理，双方当事人对合议组成员以及书记员无回避请求，对对方出庭人员的身份资格无异议。在口头审理过程中，合议组对请求人提出的无效宣告请求理由和事实逐一进行了调查，双方当事人充分陈述了各自的意见。口头审理中认定的事实如下：（1）请求人当庭放弃了证据4，并在口审辩论结束之前提交了证据1－3、5、6的原件，专利权人核实了证据原件，对证据1－3、5、6没有提出异议。（2）请求人确认其无效理由和范围为：本专利说明书不符合专利法第26条第3款；权利要求1、3、4相对于证据1或2不符合专利法第22条第3款的规定，证据5和6作为佐证；权利要求2相对于证据1和3或证据2和3不符合专利法第22条第3款的规定。
至此，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
1、审查文本
本无效宣告请求审查决定所依据的文本为本专利的授权公告文本。
2、无效宣告请求的理由和范围
根据请求人在无效宣告请求书和口头审理过程中的确认，其请求宣告本专利权无效的理由和范围是：本专利说明书不符合专利法第26条第3款；权利要求1、3、4相对于证据1或2不符合专利法第22条第3款的规定，证据5和6作为佐证；权利要求2相对于证据1和3或证据2和3不符合专利法第22条第3款的规定。
3、关于证据
专利权人对证据1－3、5和6的真实性、合法性和关联性没有提出异议。合议组认可所述证据的真实性、合法性和关联性。其中证据1－3均为公开出版物，公开日在本专利申请日之前，可以作为判断本专利权利要求1－4是否具备创造性的对比文件。
4、关于原专利法第22条第3款
原专利法第22条第3款规定，创造性，是指同申请日以前已有的技术相比，该发明有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型有实质性特点和进步。
当一项发明专利权利要求保护的技术方案与请求人提供的最接近的现有技术相比存在区别特征时，如果请求人提供的同一份对比文件的其它部分或其它对比文件均未给出将该区别技术特征应用到最接近的现有技术中以解决发明实际要解决的技术问题的启示，而且引入了所述区别特征的该权利要求的技术方案产生了有益的技术效果，则该权利要求相对于请求人提供的证据而言具备创造性。
本专利权利要求1要求保护一种有核细胞体外分离试剂盒，其特征在于该试剂盒中包含有红细胞沉淀剂、细胞保养液和泛影酸钠-聚蔗糖400#或HISTOPAQUE1077。证据1（参见第89页“脐血MSC的体外分离、纯化和扩增培养”部分）公开了人脐血间充质干细胞（MSC）体外分离的方法，其中采用磷酸缓冲液（PBS）作为细胞保养液对细胞进行稀释，采用5g/L甲基纤维素作为红细胞沉淀剂以及相对密度1.077的淋巴细胞分离液分离细胞。将权利要求1请求保护的三个并列技术方案中涉及甲基纤维素的技术方案与证据1公开的技术方案进行对比可以看出，证据1和本专利权利要求1均涉及有核细胞的分离试剂和方法，试剂包括了红细胞沉淀剂、细胞保养液和细胞分离液。其中细胞保养液均采用了PBS，细胞沉淀剂均使用了甲基纤维素，而且证据1中甲基纤维素的浓度落入本专利权利要求1中限定的浓度范围内。二者的区别特征在于：（1）本专利权利要求1要求保护的是试剂盒， 其中的细胞分离液采用了两种具体的相对密度1.077的淋巴细胞分离液――泛影酸钠-聚蔗糖400#或HISTOPAQUE1077，红细胞沉淀剂的水溶液pH值为7-8；而证据1公开的是MSC的分离试剂和方法, 采用了密度1.077的淋巴细胞分离液，未明确限定沉淀剂pH值。（2）本专利权利要求1限定红细胞沉淀剂还包括0.2－0.4％的葡萄糖酸钙，而证据1中仅含有甲基纤维素。基于上述区别技术特征，本专利权利要求1实际要解决的技术问题是提供一种有核细胞存活率和回收率较高的有核细胞的体外分离试剂盒。对于上述区别技术特征（2），证据1以及请求人提供的其他现有技术证据均没有公开包含葡萄糖酸钙的“红细胞沉淀剂”，也没有证据表明在有核细胞分离的过程中加入葡萄糖酸钙是本领域技术人员的公知常识。而且，根据说明书第2页第11-12行的记载可知，采用了上述试剂盒的分离方法既能分离骨髓又能分离脐带血，所分离出的有核细胞存活率≥98％，有核细胞回收率≥85％。可见，引入了上述区别技术特征的权利要求的技术方案产生了有益的技术效果。综上所述，现有技术未给出将上述区别特征（2）应用到证据1公开的技术方案中以解决其实际要解决的技术问题的启示，同时引入了所述区别特征的权利要求1的技术方案产生了有益的技术效果，权利要求1中涉及甲基纤维素的技术方案相对于证据1具备创造性，同理，涉及其他两种红细胞沉淀剂的技术方案相对于证据1也具备创造性。
证据2（参见第305页第2段）公开了羟乙基淀粉沉降法分离脐血的方法。其中仅公开了权利要求1试剂盒中的羟乙基淀粉，而没有公开其他的技术特征。如上所述，证据2以及请求人提供的其他现有技术证据均没有公开包含葡萄糖酸钙的“红细胞沉淀剂”，也没有证据表明在有核细胞分离的过程中加入葡萄糖酸钙是本领域技术人员的公知常识。同时引入了所述区别特征的权利要求1的技术方案产生了有益的技术效果，因此，请求人认为权利要求1相对于证据2不具备创造性的理由也不成立。
本专利从属权利要求2进一步限定了权利要求1中泛影酸钠-聚蔗糖400#的组成和pH值，证据3（第1－3页）公开了淋巴细胞分层液聚蔗糖-泛影酸钠（ficoll-hypaque，F/H）有成品供应。但由于权利要求1相对于证据1或2存在区别技术特征“红细胞沉淀剂中还包含0.2－0.4％的葡萄糖酸钙”，证据3中既没有公开该区别技术特征，也没有给出将上述区别技术特征应用于证据1或2的技术启示，在独立权利要求1相对于证据1或2具备创造性的前提下，从属权利要求2相对于证据1和3或证据2和3的结合也具备创造性。从属权利要求3进一步限定权利要求1细胞保养液为磷酸缓冲液或生理盐水，在独立权利要求1相对于证据1或2具备创造性的前提下，从属权利要求3相对于证据1或2也具备创造性。权利要求4要求保护一种如权利要求1所述的有核细胞体外分离试剂盒的应用方法。在权利要求1要求保护的试剂盒相对于证据1或2具备创造性的前提下，所述的应用方法相对于证据1或2也具备创造性。
请求人认为：（1）证据5、6是专利权人生产的标注有本专利专利号的产品说明书和“医疗器械注册证”，其中均未记载葡萄糖酸钙这一组分，说明在具体实施本专利时葡萄糖酸钙并非必要组分。（2）本专利说明书实施例中并没有加入钙离子可以降低细胞死亡率的试验数据和相关对比试验，专利权人主张的技术效果仅仅是一种断言，得不到有效试验数据的支持。对此，合议组认为：（1）没有证据表明专利产品说明书以及所述“医疗器械注册证”必须写明其所涉及专利的所有组分或公开其全部技术特征，证据5和6在其标明的主要成分（组分）中没有涉及葡萄糖酸钙并不表明葡萄糖酸钙就一定不是其必要组分，在分离有核细胞时没有发挥作用。（2）本专利说明书虽然没有记载加入钙离子前后有关细胞存活率的对比试验数据，但是鉴定有核细胞分离方法中细胞存活率的技术方法是本领域技术人员的常规技能，在没有证据表明本专利说明书实验数据不符合实际情况或不可能实现的情况下，没有理由质疑本专利说明书中记载的实验数据。因此，请求人认为本专利权利要求1-4不具备创造性的理由不成立。
5、关于专利法第26条第3款
专利法第26条第3款规定，说明书应当对发明或者实用新型作出清楚、完整的说明，以所属技术领域的技术人员能够实现为准。
如果所属技术领域的技术人员按照说明书记载的内容，就能够实现该发明的技术方案，解决其技术问题，并且产生预期的技术效果，则说明书对该发明作出了清楚、完整的说明。
本案中，请求人认为由于本专利说明书多处记载含糊不清或语义矛盾、逻辑混乱，导致本领域技术人员无法实现本发明的技术方案。
经审查，合议组认为，说明书第1页第25行的“另一是目的”属于明显的文字错误，结合上下文的语义，本领域技术人员可以理解其含义为“另一目的是”；对于说明书第2页第4行的“钙水溶液PH为7-8”，根据上下文的记载，以及权利要求2中与此相同的内容可知，其限定的是泛影酸钠-聚蔗糖400＃的pH，而权利要求2中记载为“该水溶液PH值为7～8”，因此本领域技术人员可以理解“钙水溶液PH为7-8”实为“该水溶液PH为7-8”的笔误所致；说明书第2页的第6行的“应用方法”与“工艺过程”虽然叙述方式不同，但实际的含义是清楚的；说明书第2页的第28行所限定的“1200转／8分钟”的离心速度虽然不符合本领域技术人员对转速描写的规范，但是分离细胞的离心操作是本领域技术人员的常规技能，其中采用的一般转速也是本领域技术人员已知的，而且说明书第2页的第30行还同时记载了“转速控制在1200转/分”的技术特征，因此本领域技术人员可以依据其掌握的技术常识判断应当采用的适宜转速，“1200转／8分钟”的文字记载并不影响实施本专利的技术方案；说明书第2页的第31行“用臭酚兰检测细胞存活率”的技术内容，“臭酚蓝”这一检测细胞活力的物质在本领域是不存在的，本领域技术人员可知其明显是错误的，在字形上与“臭酚蓝”相似的物质有“溴酚蓝”，而“溴酚蓝”是本领域技术人员熟知的核酸指示剂，无法用于检测细胞活力。但是，本领域技术人员公知检测细胞活力的物质，例如“苔盼蓝”等，因此本领域技术人员可以根据其掌握的技术常识采用合理的细胞活力检测剂来检测细胞存活率；对于说明书第3页第5-6行记载的“红细胞沉淀剂：1.2％的羟乙基淀粉与0.2％的葡萄糖酸钙加水溶解所得的溶解液”，第15-16行记载的“红细胞沉淀剂：0.8％的甲基纤维素与0.3％的葡萄糖酸钙加水溶解所得的溶解液”，本领域技术人员已知羟乙基淀粉和葡萄糖酸钙均是固体，根据权利要求1记载的内容，以及说明书第1页最后1行-第2页第2行的记载“所述红细胞沉淀剂是指由0.4%~1.2％的羟乙基淀粉或羟甲基淀粉或甲基纤维素与0.2％~0.4%的葡萄糖酸钙组成的水溶液”，本领域技术人员可以毫无疑义地判断所述的记载实际上为配置成终浓度为1.2％的羟乙基淀粉与0.2％的葡萄糖酸钙或0.8％的甲基纤维素和0.3％的葡萄糖酸钙的水溶液。综上所述，虽然本专利说明书的撰写存在瑕疵和错误，但并不至于使得本领域技术人员无法实施，因此，请求人认为本专利的说明书不符合专利法第26条第3款规定的理由不成立。
三、决定
维持第200610106875.5号发明专利权有效。
当事人对本决定不服的，可以根据专利法第46条第2款的规定，自收到本决定之日起三个月内向北京市第一中级人民法院起诉。根据该款的规定，一方当事人起诉后，另一方当事人作为第三人参加诉讼。
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