发明创造名称：N-端化学修饰的蛋白质组合物及方法
外观设计名称：
决定号：10295
决定日：2007-07-30
委内编号：4W01416
优先权日：1994-10-12
申请（专利）号：95191454.5
申请日：1995-02-08
复审请求人：
无效请求人：杭州九源基因工程有限公司
授权公告日：2001-09-26
审定公告日：
专利权人：安姆根有限公司
主审员：吴通义
合议组组长：李金光
参审员：叶娟
国际分类号：C07K 14/53；C07K 14/555；C07K 1/107；A61K 47/48
外观设计分类号：
法律依据：专利法实施细则第20条第1款，专利法第26条第4款
决定要点：每项权利要求所确定的保护范围应当清楚，用语“类似物”通常会使得权利要求的保护范围不清楚。
根据该款规定，如果权利要求所保护的技术方案是本领域技术人员能够从说明书充分公开的内容中得到或概括得出的，并且未超出说明书公开的范围，则该权利要求能够得到说明书的支持。
全文：
一、案由
本无效宣告请求案涉及国家知识产权局于2001年9月26日公告授予的、名称为“N-端化学修饰的蛋白质组合物及方法”的第95191454.5号发明专利（下称本专利），其申请日为1995年2月8日，优先权日为1994年10月12日，专利权人为安姆根有限公司。本专利授权公告的权利要求如下:
“1.N-末端单聚乙二醇化的G-CSF或其类似物的基本上均一制品，任选存在于药用稀释剂、载体或佐剂中。
2.权利要求1的制品，其中所说的聚乙二醇具有在2kDa到100kDa之间的分子量。
3.权利要求2的制品，其中所说的聚乙二醇具有在6kDa到25kDa之间的分子量。
4.权利要求1至3中任一项的制品，其中所说的制品由至少90％的N-末端单聚乙二醇化的G-CSF或其类似物及至多10％的未发生聚乙二醇化的G-CSF或其类似物组成。
5.权利要求4的制品，其中所说的制品由至少95％的N-末端单聚乙二醇化的G-CSF或其类似物及至多5％的未发生聚乙二醇化的G-CSF或其类似物组成。
6. 权利要求1至5中任一项的制品，其中所述G-CSF具有与SEQ ID NO：1一致的序列。
7. N-末端单聚乙二醇化的G-CSF的基本上均一的制品，其中：(a)所说的G-CSF具有与SEQ ID NO.1一致的氨基酸序列；(b)所说的G-CSF用分子量为12kDa的聚乙二醇部分单聚乙二醇化。
8.一种G-CSF或其类似物的混合的制品，其含有与多聚乙二醇化的G-CSF或其类似物制品混合的N-末端单聚乙二醇化的G-CSF或其类似物制品，其中单聚乙二醇化的G-CSF或其类似物制品的比例是预定的。
9.权利要求8的混合的制品，其中N-末端单聚乙二醇化的G-CSF制品选自权利要求1至7中的那些。
10.一种药用组合物，其含有有效量的选自权利要求1-9中任一项的制品，和药用稀释剂、佐剂或载体。
11.权利要求1至9中任一项的制品在制备用于治疗以造血或免疫功能减退为特征的疾病的药物中的应用。
12.权利要求11的应用，其中疾病是由化疗、放疗、感染性疾病、严重慢性嗜中性粒细胞减少症或白血病引起的。
13.制备N末端单聚乙二醇化G-CSF或其类似物的方法，其包括如下步骤：
在还原性烷基化反应条件下，在足够酸性以选择性地激活α-氨基的pH值下，在含水介质中将在N末端具有α-氨基的G-CSF或其类似物与具有单个醛基的水溶性聚乙二醇反应，
任选从反应混合物中分离N末端单聚乙二醇化的产物。
14.权利要求13的方法，其中所说的聚乙二醇具有在2kDa到100kDa之间的分子量。
15.权利要求14的方法，其中所说的聚乙二醇具有在6kDa到25kDa之间的分子量。
16.权利要求13至15中任一项的方法，其中所说的聚乙二醇是甲氧聚乙二醇醛。
17.权利要求13至16中任一项的方法，其中在还原性烷基化中所用的还原剂是硼氢化钠、氰基硼氢钠。
18.权利要求13至17中任一项的方法，其中G-CSF或其类似物是非糖基化的。
19.权利要求13至18中任一项的方法，其中G-CSF或其类似物在N末端第-1位有甲硫氨酸部分。
20.权利要求13至19中任一项的方法，其中分离步骤（b）包括纯化。
21.权利要求20的方法，其中纯化包括反应混合物的离子交换色谱和分子筛层析。”
针对上述专利权, 杭州九源基因工程有限公司(下称请求人)于2006年2月21日向专利复审委员会提出无效宣告请求，认为本专利权利要求1和8不符合专利法第22条第2款、权利要求1～18不符合专利法第26条第4款、权利要求1～18不符合专利法实施细则第20条第1款的规定。为支持其主张，请求人提交了下述附件作为证据：
附件1:“蛋白质和肽类分子的聚乙二醇化化学”，姜忠义等人，有机化学，第23卷第12期：1340～1347页，2003，复印件共8页；
附件2:美国专利文献US5252714A，公开日为1993年10月12日，复印件共6页；
附件3：“Modification of Recombinant Human Granulocyte Colony-Stimulating Factor(rhG-CSF) and Its Derivative ND 28 with Polyethylene Glycol”，Motoo Yamasaki等人，J.Biochem，115：814～819，1994，复印件共6页；
附件4：“Modification of CD4 Immunoadhesin with Monomethoxypoly(ethyleneglycol) Aldehyde via Reductive Alkylation”，Steven M. Chamow等人，Bioconjugate Chem，5：133～140，1994，复印件共8页；
附件5：附件2的部分译文，共1页；
附件6：附件3的部分译文，共4页；
附件7：附件4的部分译文，共2页。
请求人认为：（1）本专利方法主要是利用了醛基与氨基的反应特性，其方法权利要求范围应当限于在还原性烷基化反应条件下，在足够酸性以选择性激活α-氨基的pH下，在含水介质中将在N末端具有α-氨基的G-CSF或其类似物与具有单个醛基的水溶性聚乙二醇反应。在本专利说明书仅公开了单甲氧聚乙二醇丙醛对G-CSF蛋白N-末端α-氨基进行选择性修饰的实例的基础上，应当限于具有单个醛基的水溶性聚乙二醇单一修饰N-末端具有α-氨基的G-CSF或其类似物的制品。“单聚乙二醇化”的含义是模糊的，是一个上位概念，表示一个聚乙二醇分子与G-CSF的N-端偶联，其可能是聚乙二醇醛、聚乙二醇活泼酯或其他聚乙二醇衍生物，甚至是单纯的聚乙二醇分子。聚乙二醇衍生物是一大类化合物的总称，不是所有的聚乙二醇衍生物都能够选择性与G-CSF蛋白N-端α-氨基反应，从而得到比较均一的单聚乙二醇/蛋白质连接物分子，因此，权利要求1～18中涉及“单聚乙二醇化”表述的权利要求得不到说明书的支持。说明书实施例仅列举了G-CSF聚乙二醇化修饰的实例，而说明书定义的G-CSF类似物包括具有氨基酸添加、缺失和/或取代的产物，相应的蛋白质成千上万，权利要求1的“G-CSF或其类似物”的表述超出了说明书公开的范围。当类似物的N-末端氨基酸残基为脯氨酸时，不能与醛基反应，按照权利要求13的方法得不到权利要求1的产品，权利要求1中类似物的表述超出说明书公开的范围。权利要求1～18中涉及“G-CSF或其类似物”的表述的权利要求得不到说明书的支持。（2） “单聚乙二醇化”、“G-CSF或其类似物”和“基本上均一的制品”的表述不清楚，权利要求1～18不清楚。（3）附件3公开了一种PEG修饰G-CSF及其突变体ND-28的方法，所用的PEG衍生物为PEG-NHS，获得3个PEG分子、2个PEG分子以及单个PEG分子分别连接到G-CSF或ND-28上的聚合物，其纯度均大于95％，该方法中的反应pH为7.5，G-CSF蛋白质N-末端α-氨基更容易对PEG-NHS上的羧基发生亲核进攻，N-末端修饰的产物比例相对较高，其产物中必定含有N-末端单聚乙二醇化修饰的G-CSF。该方法可以获得包括PEG单修饰G-CSF赖氨酸残基上ε-氨基和PEG单修饰G-CSF蛋白N-末端α-氨基的聚合产物，其蛋白纯度在95％以上，或者获得PEG单修饰G-CSF赖氨酸残基上ε-氨基、单修饰G-CSF蛋白N-末端α-氨基以及多位点修饰的混合物，破坏了权利要求1和8的新颖性。
2006年3月7日，请求人再次提交了一份所主张的无效宣告请求理由和范围以及所附的相应证据与2006年2月21日所提交内容完全一致的无效宣告请求，并对前次请求书中的专利号进行更正。
2006年7月25日，请求人提交了补正书，将其无效宣告请求书第③栏中的发明创造名称由“N-末端化学修饰的蛋白质组合物及方法”补正为“N-端化学修饰的蛋白质组合物及方法”。
经形式审查合格后，专利复审委员会受理了上述请求，于2006年8月7日向双方当事人发出《无效宣告请求受理通知书》，并将请求人于2006年2月21日提交的《专利权无效宣告请求书》及其所附文件的副本转送给专利权人，要求其在指定的期限内答复，同时成立合议组对本无效请求案进行审理。
专利权人于2006年9月22日作出答复，认为本专利符合专利法第22条第2款、第26条第4款和专利法实施细则第20条第1款的规定，专利权人同时提交如下附件：
附件A-1：对附件5的译文修正件，共1页；
附件A-2：附件A-1的修正内容标示件，共1页；
附件B-1：对附件6的译文修正件，共3页；
附件B-2：附件B-1的修正内容标示件，共4页；
附件C-1：对附件7的译文修正件，共1页；
附件C-2：附件C-1的修正内容标示件，共1页；
专利权人认为：（1）在本发明的制备物中，N-末端聚乙二醇化G-CSF产物中唯一的聚乙二醇产物是N-末端单聚乙二醇化的G-CSF或其类似物，任何落入本专利保护范围的产品均是只含有一个聚合物部分的N-末端聚乙二醇化G-CSF制备物，任何不是“基本上均一的”N-末端聚乙二醇化的G-CSF的产物不落入本专利的保护范围。本发明在本技术领域中首次获得其聚合物/蛋白质连接物分子中均只含一个聚合物部分的N-末端聚乙二醇化G-CSF产物，应依法享有权利要求1所限定的保护范围。术语“单聚乙二醇化”指的是连接有一个PEG分子的蛋白质，其仅覆盖了那些确能解决本发明技术问题的技术方案，本领域技术人员能够选择合适形式的PEG来制备本发明的基本上均一的制备物。另外，本专利说明书将“G-CSF类似物”定义为具有与G-CSF等同的生物学功能的多肽。请求人没有证明“单聚乙二醇化”和“类似物”的概括涵盖了不能解决本发明技术问题的技术方案，未完成举证责任。请求人认定在N-末端为脯氨酸的情况下无法得到N-末端聚乙二醇化G-CSF也只是说明此时得到的制备物并非权利要求1的制备物。因此，请求人有关专利法第26条第4款的无效理由不成立。（2）“单聚乙二醇化”、“G-CSF或其类似物”以及“基本上均一的制品”在说明书中作了清楚的定义，而且实施例2给出了“基本上均一的制品”的具体实施例，所以，本专利符合权利要求应当清楚的法律规定。（3）附件3和附件4都没有教导具体制备在α-氨基上单聚乙二醇化的G-CSF蛋白或其类似物；附件3中记载的聚合物/蛋白质连接物中包含单聚乙二醇化、二聚乙二醇化和三聚乙二醇化的连接物，虽指出有一个聚乙二醇化位点是N-末端，但是没有指出N-末端是单聚乙二醇化连接物上唯一的PEG连接位点，且没有公开“基本上均一的N-末端单聚乙二醇化的G-CSF或其类似物”，所以附件3不能破坏本专利权利要求1和8的新颖性。附件4没有公开权利要求1所限定的G-CSF蛋白质或其类似物。
2007年1月19日，合议组将请求人于2006年3月7日提交的文件的附件转送给专利权人，要求其在壹个月内答复。
2007年2月25日，专利权人提交了意见陈述书。专利权人认为请求人于2006年3月7日提交的文件与专利复审委员会于2006年8月7日发出的“无效宣告请求受理通知书所转送的有关文件完全相同，专利权人坚持在2006年9月22日提交的意见陈述书中所陈述的意见。
2007年3月22日，本案合议组向双方当事人发出《无效宣告请求口头审理通知书》，定于2007年6月4日对本专利权的无效宣告请求进行口头审理。同时，专利复审委员会本案合议组将专利权人于2006年9月22日和2007年2月25日提交的意见陈述书及其附件副本转送给请求人。
2007年6月4日，口头审理如期进行，双方当事人均委托代理人参加口头审理。在口头审理过程中，合议组就本无效宣告请求案的无效理由及证据逐一进行了调查，双方当事人充分陈述了各自的意见。口头审理中双方当事人认定的主要事实如下：（1）请求人当庭出示了盖有“中科生命图书馆藏书”红章和骑缝章的附件3和4的复印件，专利权人对附件1、3和4的真实性有异议；（2）双方当事人均认可附件A-1、附件B-1和附件C-1作为附件2～4相关内容的准确译文；（3）请求人放弃附件4；（4）请求人认为“基本均一制品”、“类似物”和“单聚乙二醇化”的概念是清楚的，但是使用这些术语的权利要求的保护范围不清楚。
2007年6月7日，请求人提交了意见陈述书和一份由中科院生命科学图书馆于2007年6月7日出具的说明附件1和3在该馆有馆藏，公众可以借阅或复印的“证明”（包括盖有“中国科学院上海生命科学研究所生命科学图书馆”红章和骑缝章的附件1复印件:“蛋白质和肽类分子的聚乙二醇化化学”，姜忠义等人，有机化学，第23卷第12期：1340～1347页，2003以及该杂志的封面页和目录页，共10页，以及附件3复印件：“Modification of Recombinant Human Granulocyte Colony-Stimulating Factor(rhG-CSF) and Its Derivative ND 28 with Polyethylene Glycol”，Motoo Yamasaki等人，J.Biochem，115：814～819，1994，共6页）。请求人在意见陈述书中坚持本专利不符合专利法第26条第4款、专利法第22条第2款和专利法实施细则第20条第1款的主张。
2007年7月18日，专利权人的代理人到专利复审委员会对请求人于2007年6月7日提交的用于证明附件1和3的真实性的文件进行核阅后，认可附件1和3的真实性。
至此，合议组认为本案的事实清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
无效宣告请求的理由和范围
请求人在提出无效宣告请求时主张的无效宣告请求的理由和范围是权利要求1～18不符合专利法第26条第4款以及专利法实施细则第20条第1款的规定，权利要求1和8相对于附件3或4不具有新颖性。请求人在口头审理时放弃了附件4。
因此，合议组审理本无效请求案的无效宣告请求理由和范围为：权利要求1～18不符合专利法第26条第4款以及专利法实施细则第20条第1款的规定，权利要求1和8相对于附件3不符合专利法第22条第2款的规定。
关于专利法第20条第1款
专利法实施细则第20条第1款规定，权利要求书应当说明发明或实用新型的技术特征，清楚、简要地表述请求保护的范围。
根据该款规定，每项权利要求所确定的保护范围应当清楚，用语“类似物”通常会使得权利要求的保护范围不清楚。
本专利权利要求1～6和8～18涉及用语“G－CSF或其类似物”。专利权人认为，本专利说明书第7页第9～28行明确定义G－CSF或其类似物为具有与G－CSF等同的生物学功能的多肽，该类似物可以是由G－CSF的氨基酸序列通过氨基酸添加、缺失和/或替代而衍生的。说明书中指明了该词具有特定的含义，使用该词语的权利要求的保护范围由于说明书中对该词的说明而被限定得足够清楚，该词不会导致权利要求的保护范围不清楚。
对此，合议组认为：按照说明书第7页第9～28行记载的内容可知，本发明涉及的G－CSF类似物是对G－CSF进行各种修饰后的具有G－CSF功能的物质。但是本专利说明书并没有记载在对G－CSF进行怎样的氨基酸添加、缺失和/或替代后，仍然具有G－CSF功能，本领域技术人员根据本专利说明书的记载不能够确定哪些物质属于本发明的G－CSF类似物，以及哪些类似物适于发生N-末端单聚乙二醇化来制备本发明的基本上均一制品，可见，虽然说明书对G－CSF类似物进行说明，但是该用语不具有清楚的外延，这导致使用该用语的权利要求的保护范围不清楚。因此，权利要求1～6和8～18不符合专利法实施细则第20条第1款的规定。
权利要求7保护N-末端单聚乙二醇化的G－CSF的基本上均一的制品。请求人认为，权利要求7中的“单聚乙二醇化”未在说明书中作出明确定义，没有指出携带了什么样的官能团的PEG分子与G-CSF共价结合，致使权利要求的概括不合理、保护范围模糊。另外，虽然说明书对“基本上均一制品”进行了定义，但是说明书实施例中用PEG选择性修饰G-CSF蛋白N-末端α-氨基，反应终产物并非100％的N-末端单聚乙二醇化的G-CSF，而是一种多组份混合物，包括大部分的N-末端单聚乙二醇化的G-CSF、少量未反应的G-CSF以及可能有的赖氨酸残基上ε-氨基被聚乙二醇修饰的G-CSF。“基本上均一的制品”使得无法明确权利要求保护的是怎样的一种产品，其中各种组分的含量关系如何，权利要求的保护范围是不明确的。
对此，合议组认为：权利要求7具体限定了结合生成所述“N-末端单聚乙二醇化的G－CSF”的G－CSF和聚乙二醇，即所述G－CSF具有与SEQ ID NO.1一致的氨基酸序列，该权利要求还明确限定了所述聚乙二醇是分子量为12kDa的聚乙二醇。而本专利说明书第6页第11～22行定义“基本上均一的”是指“观察到的每个聚合物/蛋白质连接物分子中均只含一个聚合物部分，该制品也许会包含未反应（缺乏聚合物部分）的蛋白质。……这些制品的均一性足以能够显示出均一制品所具有的优越性。”因此，权利要求7要求保护的制品是由特定的聚合物/蛋白质连接物（在N-末端共价结合一个分子量为12kDa的聚乙二醇的具有与SEQ ID NO.1一致的氨基酸序列的G－CSF）与特定G－CSF（具有与SEQ ID NO.1一致的氨基酸序列）组成，该G－CSF含量不影响该制品作为均一制品所具有的优越性。因此，权利要求7限定了构成所述基本上均一的制品，具有清楚的保护范围，符合专利法实施细则第20条第1款的规定。
关于专利法第26条第4款
专利法第26条第4款规定，权利要求书应当以说明书为依据，说明要求专利保护的范围。
根据该款规定，如果权利要求所保护的技术方案是本领域技术人员能够从说明书充分公开的内容中得到或概括得出的，并且未超出说明书公开的范围，则该权利要求能够得到说明书的支持。
权利要求7所保护N-末端单聚乙二醇化的G－CSF的基本上均一的制品，其中所述G－CSF具有与SEQ ID NO.1一致的氨基酸序列，所述聚乙二醇的分子量为12kDa。本专利说明书实施例2制备得到用分子量为12kDa的MPEG醛修饰的N-末端单聚乙二醇化的G－CSF，所述G－CSF的氨基酸序列为SEQ ID NO.1（参见本专利说明书实施例2和表4），说明书实施例2中描述了如何制备和纯化N-末端单聚乙二醇化的G－CSF的方法，说明书第17页描述了如何测定单聚乙二醇化的G－CSF浓度的方法，本领域技术人员按照说明书记载的内容，通过简单的重复操作，能够制备得到不同纯度的权利要求7所述的N-末端单聚乙二醇化的G－CSF，即，可得到权利要求7所保护的N-末端单聚乙二醇化的G－CSF的基本上均一的制品，因此权利要求7符合专利法第26条第4款的规定。合议组对请求人提出的权利要求7不符合专利法第26条第4款的主张不予支持。
鉴于以上论述已经得出权利要求1～6、8～18不符合专利法实施细则第20条第1款规定的结论，本合议组对请求人提出的权利要求1～6、8～18不符合专利法第26条第4款的规定，以及权利要求1和8相对于附件3不具有新颖性的主张不作进一步评述。
基于以上事实和理由，本案合议组作出如下审查决定。
三、决定
宣告第95191454.5号发明专利权权利要求1～6、8～18无效，在权利要求7的基础上维持本专利权有效。
当事人对本决定不服的，可以根据专利法第46条第2款的规定，自收到本决定之日起三个月内向北京市第一中级人民法院起诉。根据该款的规定，一方当事人起诉后，另一方当事人应当作为第三人参加诉讼。
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