发明创造名称：减毒HSV-1基因治疗载体
外观设计名称：
决定号：12131
决定日：2008-08-11
委内编号：
优先权日：2004-02-09
申请（专利）号：200410006492.1
申请日：2004-03-10
复审请求人：
无效请求人：北京海瑞祥天生物科技有限公司
授权公告日：2006-11-08
审定公告日：
专利权人：李小鹏
主审员：魏春宝
合议组组长：李金光
参审员：郭婷
国际分类号：C12N15/869;C12N15/11;C12N15/66;A61K48/00
外观设计分类号：
法律依据：专利法第26条第3款
决定要点：如果专利涉及的完成发明必须使用的生物材料是公众不能得到的，而专利权人又没有按照专利法实施细则第25条的规定对该生物材料进行保藏，那么该专利说明书不符合专利法第26条第3款的规定。
全文：
一．案由
本专利权无效宣告请求案涉及国家知识产权局于2006年11月8日公告授予的、名称为“ 减毒HSV-1基因治疗载体 ”的第200410006492.1号发明专利权（下称本专利），其申请日为2004年3月10日，优先权日为2004年2月9日，专利权人为李小鹏（最初申请人为李晓鹏，2006年7月14日变更为北京奥源和力生物技术有限公司，2008年7月18日变更为李小鹏）。本专利授权公告的权利要求书如下：
“1、一种减毒HSV-1基因治疗载体的制备方法，步骤如下：从野生型HSV-1病毒基因组中，先后删除ICP34.5，ICP6及ICP47基因，并在原ICP34.5的部位插入由hCMV的IE启动子引导的人类GM-CSF基因，并引入WPRE片段来增强GM-CSF在载体中的表达。
2、如权利要求1所述的减毒HSV-1基因治疗载体的制备方法，具体步骤如下：
(1)从野生型HSV-1中删除ICP34.5基因，构建HSV-1ΔICP34.5；
a.在BHK细胞中生长野生型HSV-1单纯疱疹病毒，用苯酚提取法提取全长HSV-1病毒DNA；
b.构建含有ICP34.5FlankingRegion的质粒：
将包含有ICP34.5基因的HSV-1DNA片段插入质粒pSP72的BglII位点；编码ICP34.5基因的NotI的片段经由NotI限制内切后删除后，得到 pSP72ΔICP34.5质粒；表达绿色荧光蛋白的标记基因EGFP由人类CMV病毒的IE启动子所控制；共同克隆进pSP72ΔICP34.5的NotI位点，得到pSP72ΔICP34.5CMVEGFP质粒；
c.构建删除ICP34.5基因的HSV-1病毒株：
将纯化提取的全长HSV-1病毒DNA与pSP72ΔICP34.5hCMVEGFP共同转染BHK细胞；
表达有绿色荧光EGFP的病毒斑，即为删除了ICP34.5基因的HSV-1病毒株；分次提取绿色荧光病毒斑，纯化HSV-1ΔICP34.5hCMVEGFP病毒株后，用苯酚提取法，提取该病毒的全长DNA；
(2)插入人类GM-CSF基因，构建HSV-1ΔICP34.5/hGMCSFWPRE
a. 首先设计引物，从人类肺cDNA库中PCR扩增hGMCSF基因；
正引物CTGAAGCTTATGTGGCTGCAGAATTTA
反引物TGGCTCGAGTCATTTTTGGACTGGTTT
将PCR产品克隆入pGEM-T克隆质粒中，得到质粒pGEMT-hGMCSF；用两个限制性内切酶HindIII和XhoI一起，从pGEMT-hGMCSF中分解出hGMCSF，将hGMCSF克隆入pSP72ΔICP34.5CMVEGFP的HindIII/XhoI位点中，以hGMCSF替换EGFP基因，得到新的质粒pSP72ΔICP34.5CMhGMCSF；
b.引入WPRE片段，WPRE片段用PCR扩增后，插入pSP72ΔICP34.5CMVhGMCSF的XhoI位点，得到质粒pSP72ΔICP34.5CMVhGMCSF/WPRE；
c.将纯化提取的全长HSV-1ΔICP34.5hCMVEGFP病毒DNA与质粒DNApSP72ΔICP34.5hCMVhGMCSFWPRE共同转染BHK细胞，不表达绿色荧光的病毒斑表示原病毒中的EGFP基因由hGMSCF基因经重组而替代，纯化及生长HSV-1ΔICP34.5hCMVhGMCSFWPRE病毒载体，提取该载体全长DNA以备后用；
(3)删除ICP6基因，构建HSV-1ΔICP34.5GMCSFWPREΔICP6病毒载体
a.构建pΔICP6质粒：
从HSV-1病毒载体中删除ICP6基因，ICP6基因在HSV-1基因组中位于
nt86444-89857；
经PCR从HSV-1DNA中扩增得到上游及下游的FlankingRegions：上游
(U/S)84859-86119；下游(D/S)90960-92579；
将PCR扩增所得的上述两个DNA片段克隆入pBlueScript质粒中，得到
pBSΔICP6质粒；
b.在原来已构建的质粒PGEMT-MMLVEGFP中：
用两个限制性内切酶SalI和XhoI分解出MMLV-EGFP-SPA片段，插入 pBSΔICP6的PstI位点，即得到pBSΔICP6EGFP质粒；
c.将前面所纯化的HSV-1ΔICP34.5hGMCSFWPRE全长病毒的DNA与 pBSΔICP6EGFP质粒DNA一起共同转染BHK细胞，挑选并纯化表达有绿色荧光的病毒斑，所得到的病毒载体即为HSV-1ΔICP34.5hGMCSFWPREΔICP6EGFP；生长并提取该载体全长DNA；
d.将所纯化的HSV-1ΔICP34.5hGMCSFWPREΔICP6EGFP全长病毒DNA与
pBSΔICP6质粒DNA一起共同转染BHK细胞，不表达绿色荧光的病毒斑即表
示原病毒载体中的EGFP基因经重组后删除，从而得到病毒载体
HSV-1ΔICP34.5hGMCSFWPREΔICP6，生长并提取该载体全长DNA；
(4)删除ICP47基因，构建HSV-1ΔICP34.5GMCSFWPREΔICP6ΔICP47病毒载体
a.构建ΔICP47质粒：
经PCR从HSV-1DNA中扩增得到其上游及下游的FlankingRegions，
上游(U/S)nt145570-146980DNA片段；
所用正引物为：GCATCGATCTTGTTCTCCGACGCCATC
所用反引物为：GCAAGCTTGCTCCCCCCCGACGAGCAGGAAG
下游(D/S)nt143675-145290DNA片段；
所用正引物为：TCTAGAGGGTTCGATTGGCAATGTTGTCTCCCG
所用反引物为：TTAACGATCGAGTCCCGGGTACGACCATCACCCG
将上述PCR所得ICP47FlankingRegionDNA片段克隆进pBlueScript质粒中：先将上游DNA片段，经HindIII和Sal1水解后，连接到pBlueScript 质粒的HindIII和Sal1位点，得pBS47US；
将下游DNA片段克隆进pGEMT质粒，用EcoRI从其中切下下游DNA，将其插入pBS47US的Spel位点，即得到pBSΔICP47质粒；
b.从前述的pGEMT-MMLVEGFP质粒中，用SalI/xhoI分解出MMLV-EGFP-SpaDNA片段，将其插入pBSΔICP47的BamHI位点中，即得到pBSΔICP47EGFP质粒；
c.将前面所纯化的HSV-1ΔICP34.5hGMCSFWPREΔICP6全长病毒DNA与pBSΔICP47EGFP质粒DNA一起共同转染BHK细胞，挑选并纯化表达有绿色荧光的病毒斑，所得到的病毒载体即为HSV-1ΔICP34.5hGMCSFWPREΔICP6ΔICP47EGFP，生长并提取该载体全长DNA；
d.将所纯化提取的HSV-1ΔICP34.5hGMCSFWPREΔICP6ΔICP47EGFP全长病毒DNA与pBSΔICP47质粒DNA一起共同转染BHK细胞，不表达绿色荧光的病毒斑即表示原病毒载体中的EGFP基因经重组后删除，最后得到了最终的病毒载体HSV-1ΔICP34.5hGMCSFWPREΔICP6ΔICP47，该载体即是减毒HSV-I基因治疗载体。
3、如权利要求2所述的减毒HSV-1基因治疗载体的制备方法，其中野生型HSV-1与NCBI中的ID：NC_001806的HSV-1 17 株具有相同的限制性内切酶分解模式。
4、一种由权利要求1、2或3的制备方法制备的减毒HSV-1基因治疗载体。
5、一种药物组合物，由权利要求4的减毒HSV-1基因治疗载体和药物可接受的载体或赋形剂组成。
6、如权利要求4所述的减毒HSV-1基因治疗载体在制备基因治疗肿瘤的药物中的应用。”
针对上述专利权，北京海瑞祥天生物科技有限公司（下称请求人）于2007年12月24日向专利复审委员会提出专利无效宣告请求，认为本专利不符合专利法第26条第3款和专利法实施细则第13条第1款的规定。请求人同时提交了本专利的授权公告文本、发明专利证书复印件及以下证据：
证据1：申请号为01806743.3、公开号为CN1418255A的中国发明专利申请公开说明书，申请日为2001年1月22日，公开日为2003年5月14日，申请人为拜奥维克斯有限公司，全文共18页；
证据2：申请号为01806750.6、授权公告号为CN1250732C的中国发明专利说明书，申请日为2001年1月22日，公开日为2006年4月12日，申请人为拜奥维克斯有限公司，全文共34页。
请求人认为：（1）（a）本专利涉及野生型单纯疱疹病毒I型（HSV-1），但是本专利说明书没有清楚描述HSV-1的制备方法，没有说明产生该病毒的组织、细胞来源，本领域技术人员不花费创造性劳动无法实现本专利请求保护的基于HSV-1的技术方案。（b）本专利保护的减毒基因的肿瘤治疗功效仅通过动物实验方法得出，没有提供生物学试验加以证实；对于请求保护的减毒基因的制药用途及基因治疗用途，说明书没有公开具体的实施方式和效果证明试验；因此，本领域技术人员无法预见所述减毒基因能够产生预期的技术效果。（c）肿瘤治疗功效试验中列出多种肿瘤细胞，但是没有明确具体使用哪种肿瘤细胞；没有提供细胞的检测分析结果，仅依据肿块的缩小和消失来证明减毒基因的肿瘤治疗功效；因此本专利说明书的实验方法公开不具体。（d）构建HSV-1ΔICP34.5/hGMCSFWPRE，首先需要选择合适来源的基因组DNA构建文库，本专利说明书中没有描述从何种人的何种细胞或组织构建文库，由于不同种、不同个体以及不同组织间存在基因表达差异，本领域技术人员不花费创造性劳动无法确定从何种人的何种组织或细胞中筛选出编码本申请所述的hGMCSF基因。说明书对于如何用HindIII和XhoI从pGEMT-hGMCSF中分解出hGMCSF，如何将hGMCSF克隆入pSP72ΔICP34.5CMVEGFP的HindIII/xhoI位点，没有给出具体的方法和方案，也没有具体描述如何用hGMCSF替换EGFP基因得到新的质粒pSP72ΔICP34.5CMhGMCSF，本专利说明书对于引入WPRE片段表达不充分。因此，本专利说明书没有充分公开权利要求2中的“插入人类GM-CSF基因，构建HSV-1ΔICP34.5/hGMCSFWPRE”步骤。（e）本专利的减毒的基因序列公开不充分，导致相关的制备方法及用途的权利要求在说明书中没有充分公开。综上所述，本专利说明书没有清楚、完整地说明请求保护的技术方案，因而不符合专利法第26条第3款的规定。（2）（a）本专利的核心权利要求是一种减毒HSV-1基因治疗载体，这与证据1的核心权利要求一种疱疹病毒及证据2的核心权利要求HSV-1毒株具有相同的特征，即缺乏功能性ICP34.5编码基因和功能性ICP47编码基因，这在本专利、证据1及证据2的权利要求1中都有相同的表述；（b）根据本专利说明书第3页、证据1说明书第2页及证据2说明书第8页附图简述中的图1、说明书第15页内容可知，本专利所述的基因治疗载体与证据1中的疱疹病毒及证据2中的HSV1毒株的特征完全一致，其核心特征是经过改进、修饰后缺少了ICP6、ICP47及ICP34.5基因；（c）本专利中病毒的另一主要特征是在基因组中插入人类GMCSF基因（见本专利说明书第3页），与证据1中毒株的特征完全一致（见证据1说明书第6页）；（d）本专利所述的药物组合物（见本专利说明书第2页）与证据1的权利要求17所述的药物组合物为相同的药物组合物，本专利、证据1及证据2中都有药物组合物的权利要求，此权利要求使基因载体在功能表现形式上具有相同的特征；（e）根据本专利说明书第1页、证据1说明书第3页及证据2第6、7页所述内容，本专利与证据1及证据2的载体在肿瘤治疗中的功能和应用具有相同的特征。因此，本专利与证据1和证据2属于同样的发明创造，不符合专利法实施细则第13条第1款的规定。
经形式审查合格后，专利复审委员会受理了上述请求，于2008年1月28日向双方当事人发出《无效宣告请求受理通知书》，并将《专利权无效宣告请求书》及其附件副本转送给专利权人，要求其在指定的期限内答复，同时成立合议组对本无效宣告请求案进行审理。
专利权人在指定期限内没有针对上述转文进行答复。
2008年4月1日，本案合议组向双方当事人发出无效宣告请求口头审理通知书，定于2008年6月4日对本案进行口头审理。
2008年6月4日，口头审理如期进行。双方当事人代理人均参加了口头审理，口头审理过程中认定的事实如下：（1）双方对于对方出庭人员的身份、资格均无异议；对合议组成员无回避请求。（2）请求人明确放弃了证据1。（3）专利权人对证据2的关联性、真实性、合法性和公开性无异议。（4）请求人认为本专利不符合专利法实施细则第13条第1款的规定，因为以下权利要求构成了同样的发明创造：本专利的权利要求1、2分别与证据2的权利要求8；本专利权利要求1、2、3分别与证据2的权利要求11；本专利的权利要求4与证据2的权利要求8；本专利的权利要求5与证据2的权利要求9；本专利的权利要求6与证据2的权利要求10。（5）请求人强调：仅凭本专利说明书中对毒株来源的描述，本领域技术人员无法确定基因来源，无法获得本专利所述的野生型毒株。除了坚持无效宣告请求书中的意见外，还认为：本专利说明书中所主张的“WPRE的引入能使GMCSF表达量提高2-3倍”没有实验数据支持；本专利说明书附图4、6、12中两个插入原件的方向应该是相反的，因此其中一个的方向明显错误；因此本专利说明书没有对权利要求1-6请求保护的技术方案作出清楚完整的说明，不符合专利法第26条第3款的规定。对此，专利权人认为：本专利所述的野生型毒株与17＋株具有相同的酶切模式，可以互换，但所制备的基因治疗载体的效果不同；本专利说明书中只记载了WPRE引入使GMCSF表达量提高的实验结果，没有记载具体实验数据；本专利说明书附图4、6和12中存在请求人所述的错误，但是本领域技术人员可以不依赖附图，按照说明书文字部分记载内容实现请求保护的发明。（6）口头审理时本专利的专利权人变更请求正处于审查阶段，该变更请求为将专利权人由北京奥源和力生物技术有限公司变更为李小鹏，参加口头审理的专利权人北京奥源和力生物技术有限公司代理人李小鹏即为欲变更专利权人李小鹏，李小鹏明确表示其当庭陈述既是现专利权人的意见，也能代表欲变更专利权人的意见，并提交了现专利权人的委托书。
2008年7月18日，国家知识产权局发出《手续合格通知书》，本专利的专利权人被变更为李小鹏。
至此，合议组认为本案事实已经清楚，可以依法作出审查决定。
二．决定的理由
（一）无效宣告请求的理由和范围
根据请求人在口头审理中的确认，合议组确定本无效宣告请求案审理的理由和范围是：（1）本专利权利要求1-6相对于证据2不符合专利法实施细则第13条第1款的规定；（2）本专利说明书没有对权利要求1-6作出清楚完整的说明，不符合专利法第26条第3款的规定。
（二）关于专利法第26条第3款
专利法第26条第3款规定：“说明书应当对发明或者实用新型作出清楚、完整的说明，以所属技术领域的技术人员能够实现为准”。
如果专利涉及的完成发明必须使用的生物材料是公众不能得到的，而专利权人又没有按照专利法实施细则第25条的规定对该生物材料进行保藏，那么本专利说明书不符合专利法第26条第3款的规定。
本专利权利要求1-3保护制备减毒HSV-1基因治疗载体的方法，权利要求4保护该方法制备的减毒HSV-1基因治疗载体，权利要求5保护由所述减毒HSV-1基因治疗载体和药物可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物，权利要求6保护所述的减毒HSV-1基因治疗载体在制备基因治疗肿瘤的药物中的应用。由此可见，本专利所有权利要求的技术方案均以本专利所述HSV-1基因治疗载体能够制备得到为基础，所述载体是以野生型HSV-1病毒为起始生物材料，经基因重组技术构建而成的。
根据本专利说明书可知，本专利所解决的技术问题和达到的技术效果是：现有技术中的用感染欧美人群的HSV-1病毒株（17＋株或F株）开发的HSV-1基因治疗载体对亚洲人群难以产生相同的功效，本专利用首次从中国人患者口腔中分离的HSV-1病毒株，构建了一种新的HSV-1基因治疗载体，该载体对中国（亚州）人群能够达到最佳的基因治疗效果（参见本专利说明书第1页第1、2段，第5页）。由此可知，本专利首次从中国人患者口腔中所分离的野生型HSV-1病毒株是完成本专利保护发明所必须使用的生物材料。
但是，首先本专利所述的从中国人患者口腔中分离的野生型HSV-1病毒株是专利权人首次分离的，为专利权人所拥有；其次，本领域技术人员都知道，病毒毒株间的基因组普遍存在差异，本领域技术人员按照本专利说明书中分离所述野生型HSV-1病毒株的简单描述“从中国人患者口腔分离”（本专利说明书第1页第16行、第5页第6行），不清楚如何获得所述HSV-1毒株，更不能重复获得用于制备能实现本发明技术效果的基因治疗载体的所述HSV-1毒株。因此，本专利完成发明必须使用的生物材料（专利权人首次分离的野生型HSV-1毒株）是公众不能获得的。专利权人没有按照专利法实施细则第25条的规定进行保藏，在此情况下，本领域技术人员根据本专利说明书记载内容无法完成权利要求1-6的技术方案，无法实现预期的技术效果。因此，本专利说明书不符合专利法第26条第3款的规定，本专利权利要求1-6应予无效。
鉴于以上已经得出本专利全部权利要求1-6应予无效的结论，合议组对请求人提出的其它无效宣告请求理由和证据不再评述。
基于以上事实和理由，本案合议组作出如下审查决定。
三．决定
宣告第200410006492.1号发明专利权全部无效。
当事人对本决定不服的，可以根据专利法第46条第2款的规定，自收到本决定之日起三个月内向北京市第一中级人民法院起诉。根据该款的规定，一方当事人起诉后，另一方当事人应当作为第三人参加诉讼。
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