发明创造名称：分离筛选异养硝化细菌的方法
外观设计名称：
决定号：14711
决定日：2010-04-08
委内编号：4W02790
优先权日：
申请（专利）号：200510030456.3
申请日：2005-10-13
复审请求人：
无效请求人：彭光浩
授权公告日：2007-09-26
审定公告日：
专利权人：上海交通大学
主审员：
合议组组长：尹昕
参审员：冯怡
国际分类号：C12Q 1/04; C12N 1/20
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款; 专利法第26条第3款
决定要点：如果本领域技术人员在最接近的现有技术公开的技术方案的基础上，能够通过结合其他现有技术公开的内容以及本技术领域的技术常识显而易见地得到涉案专利权利要求中的技术方案，且没有证据表明所述技术方案取得了预料不到的技术效果，则该权利要求不具有突出的实质性特点，不具备创造性。
全文：
一．案由
本专利权无效宣告请求案涉及国家知识产权局于2007年9月26日公告授予的、名称为“分离筛选异养硝化细菌的方法”的第200510030456.3号发明专利权（下称本专利），其申请日为2005年10月13日，专利权人为上海交通大学。本专利授权公告的权利要求书如下:
“1、一种分离筛选异养硝化细菌的方法，其特征在于包括如下步骤：
1）牛肉膏一蛋白胨培养基的制备：按牛肉膏10g，蛋白胨10g，NaC1 5g，1000 mL蒸馏水的比例配制液体培养基，先将牛肉膏、蛋白胨、NaCl溶解于蒸馏水中，用lmol/L的NaOH调节培养基pH为7.0-8.0形成液体培养基，经 121℃高温高压灭菌15～20分钟；在上述牛肉膏一蛋白胨液体培养基中加入15～20g琼脂，加热使其充分溶解后装于锥形瓶中，于121℃下灭菌15～20分钟，待培养基冷却至45～50℃后倾倒至灭菌的培养皿中，静置冷凝成平板，得到牛肉膏一蛋白胨培养基；
2）混合微生物菌群的稀释：将样品与无菌蒸馏水按体积比为1:9的比例放入盛有玻璃珠的容器中，密闭后振荡稀释，得到稀释10倍的样品，然后取稀释后的样品与无菌蒸馏水按同样的比例再次进行振荡稀释，共进行10次，每次稀释倍数为10倍，得到10种不同稀释度的样品：
3）混合微生物菌群的涂布：从各个稀释度的样品中均取0.1mL分别加入到制备好的牛肉膏一蛋白胨培养基平板上，用灭菌的涂布棒将稀释样品分散摊开使其干燥，每个稀释度的样品三个重复，每变化一次稀释度系列，要重新换移液管，静置冷凝后，将培养基平板扣过来放于生化培养箱30℃下培养7-10天；
4）细菌的纯化分离：在形成菌落的平板内，挑选出90-110个孤立菌落的平板，在水平层流双人净化工作台上，把装有选出平板的培养皿中的孤立菌落用接种环挑出，移植到牛肉膏一蛋白胨培养基上，30℃条件下培养7-10天，然后，再用接种环挑取一菌环细菌菌苔放到无菌水中，充分振荡，用此细菌悬液按照活菌数测定方法在平板上涂布，使其在培养皿上形成30-50个孤立的菌落，而后把孤立的菌落按照上述方法再挑菌一次，反复2-3次，即可得到经分离纯化后的异养菌株；
5）氨氧化能力鉴定培养液的制备：取葡萄糖5g/L，(NH4)2SO4 0.5 g/L；NaC1 0.3 g／L，K2HPO4 1.0 g/L，MgS04?7H2O 0.3g／L，FeS04?7H2O 0.03g／L，CaC03 7.5 g/L，充分混合溶解后分装于玻璃试管中，每只试管分装3mL，用硅胶塞塞紧，于110℃下高压灭菌20min，制得氨氧化能力鉴定培养液；
6）格利斯试剂的配制：称取对氨基苯磺酸0.5g，溶于30mL冰醋酸和100mL蒸馏水的混合液中，过滤后制得对氨基苯磺酸溶液；称取0.lg α-萘胺溶解于100mL热蒸馏水中，冷却后，加入30mL冰醋酸，过滤后制得α-萘胺溶液；将两种溶液等量混合成格利斯试剂使用；
7）液体纯培养的硝化活性验证：将经分离纯化后获得的异养菌株用接种环挑取一菌环细菌菌苔接种于氨氧化能力鉴定培养液，30℃条件下培养7-10天，培养期间每隔3天取2mL培养液至洁净试管，将格利斯试剂1-2滴直接点滴入试管中进行硝化活性确认，并以不接纯化菌株的氨氧化能力鉴定培养基作空白对照，若培养液变红即可确定菌株具有硝化活性。”
针对上述专利权，彭光浩（下称请求人）于2009年10月12日向专利复审委员会提出专利权无效宣告请求，认为本专利不符合专利法第22条第3款和第26条第3款的规定。请求人同时提交了以下附件作为证据：
附件1：申请号为03118598.3的发明专利申请公开说明书，复印件共12页；
附件2：申请号为200410005158.4的发明专利申请公开说明书，复印件共2页；
附件3：申请号为03118597.5的发明专利申请公开说明书，复印件共5页。
依据上述附件，请求人认为：（1）本专利的权利要求1涉及一种分离筛选异养硝化细菌的方法，包括牛肉膏一蛋白胨培养基的制备、混合微生物菌群的稀释、混合微生物菌群的涂布、细菌的纯化分离、氨氧化能力鉴定培养液的制备、格利斯试剂的配制和液体纯培养的硝化活性验证等步骤，并在各步骤中记载了具体详细的操作方式。附件1公开了一种分离鉴定纯化异养硝化微生物的方法，包括PM平板（牛肉膏蛋白陈培养基）的制备，样品的稀释，样品涂布于PM平板，PM平板划线纯化，格利斯试剂的配制，活性菌的鉴别，NB液体培养基的配制，和液体纯培养的硝化活性验证等步骤（参见附件1说明书第3页第13行－第6页第10行）。权利要求1与附件1相比，存在以下区别技术特征：1、氨氧化能力鉴定培养液；2、活性菌的鉴别；3、液体纯培养的硝化活性验证。然而这些区别特征已经被附件2和3公开。本领域技术人员为分离筛选异养硝化细菌，将附件1结合附件2、附件3和本领域的公知常识，有动机将上述区别特征应用到附件1的技术方案中，以得到权利要求1的技术方案，因此权利要求1是显而易见的，不具有突出的实质性特点，不符合专利法22条第3款的规定。（2）本专利关于分离筛选异养硝化细菌的方法涉及活性微生物，但在说明书中对所分离获得的异养硝化细菌的描述，没能达到使所属技术领域的技术人员能够重复实现该发明的程度。特别是在申请文件中所建议的分类命名的活性菌种（株），即“Bacillus macroides”（种）和“Brevibacillus”’（属），本领域普通技术人员无法重复实施，因此本专利不符合专利法第26条第3款的规定。
经形式审查合格后，专利复审委员会受理了上述请求，于2009年10月27日向双方当事人发出《无效宣告请求受理通知书》，并将《专利权无效宣告请求书》及其附件副本转送给专利权人，要求其在一个月内答复，同时成立合议组对本无效宣告请求案进行审理。
专利权人未对《专利权无效宣告请求书》进行答复。
至此，合议组认为本案事实已经清楚，可以依法作出审查决定。
决定的理由
（一）审查基础
本无效宣告请求审查决定以本专利授权公告的文本为审查基础。
（二）无效请求的理由和范围
根据请求人的无效宣告请求书，合议组确定本案无效宣告请求的理由和范围是：本专利权利要求1相对于附件1、附件2、附件3和本领域的公知常识不符合专利法22条第3款的规定，本专利说明书不符合专利法第26条第3款的规定。
（三）证据认定
请求人提交了3份附件作为证据用于评价本专利的创造性。附件1－3均为发明专利申请公开说明书，合议组经核实认可其真实性。附件1－3的公开日分别为2003年8月6日、2005年4月6日和2004年3月24日，早于本专利的申请日2005年10月13日，可以作为现有技术评价本专利的创造性。
（四）法律适用
本案属于根据申请日在2009年10月1日之前提出的专利申请授予的专利权，根据《施行修改后的专利法的过渡办法》和《施行修改后的专利法实施细则的过渡办法》，适用2000年8月25日第二次修正的专利法第22条第3款。
（五）关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指同申请日以前已有的技术相比，该发明有突出的实质性特点和显著的进步。
根据该款规定，如果本领域技术人员在最接近的现有技术公开的技术方案的基础上，能够通过结合其他现有技术公开的内容以及本技术领域的技术常识显而易见地得到涉案专利权利要求中的技术方案，且没有证据表明所述技术方案取得了预料不到的技术效果，则该权利要求不具有突出的实质性特点，不具备创造性。
本专利权利要求1涉及一种分离筛选异养硝化细菌的方法，包括牛肉膏－蛋白胨培养基的制备、混合微生物菌群的稀释、混合微生物菌群的涂布、细菌的纯化分离、氨氧化能力鉴定培养液的制备、格利斯试剂的配制和液体纯培养的硝化活性验证等步骤，并在各步骤中记载了具体详细的操作方式。
附件1公开了一种分离鉴定纯化异养硝化微生物的方法（参见附件1说明书第3页第13行－第6页第10行），包括以下步骤：
（1）PM平板（牛肉膏蛋白胨培养基）的制备：牛肉浸膏3克、蛋白胨5克、琼脂20克、蒸馏水1000毫升，用1N氢氧化钠调培养基pH至7.0-7.2；
（2）待检样品10倍梯度稀释：
（3）待检样品涂布于PM平板；
（4）挑取单菌落到PM平板划线纯化；
（5）NB液体培养基（氨氧化能力鉴定培养液）的配制：A.无机盐溶液的配制称取(NH4)2SO4 2.0克， NaH2PO4 0.25克，K2 HPO4 ?0.75克， MgSO4 ?7H2 O 0.03克， MnSO4 ?H2O ?0.01克，FeSO4?7H2O ?0.01克，溶解于1000毫升蒸馏水中，用1M? NaOH调培养基的pH值为7.1，分装在三角瓶中，灭菌，B. 有机碳溶液的配制。使用时取无机盐溶液90份(体积比)与有机碳溶液10份混合，形成NB培养基。
（6）格利斯试剂的配制：对氨基苯磺酸试剂(A液)：0.5克对氨基苯磺酸(Sulfanilic?acid)溶于150毫升20％的稀醋酸溶液中，贮于棕色瓶，冷藏备用；α-萘胺试剂(B液)：0.5克α-萘胺(α-naphthylamine)加到20毫升蒸馏水和150毫升20％的稀醋酸溶液中，贮于棕色瓶，冷藏备用。
（7）活性菌的鉴别（初筛）：将获得的经分离纯化后的异养菌株接种于PM平板，28℃培养10天，格利斯试剂直接点滴到平板，进行硝化活性确认，并以不接菌的平板作空白对照。1分钟内，格利斯试剂显色呈红色，表明有亚硝酸盐生成。重复验证，显色反应仍呈阳性，初步确认为硝化活性菌。
（8）液体纯培养的硝化活性验证：选取初筛时活性较强的代表性菌株进行。刮取生长于PM平板的纯菌菌苔入30毫升无菌水，使其充分分散均匀制成菌悬液。分别接种1毫升菌悬液入含不同有机物为碳源的50毫升NB培养基的250毫升锥形瓶中，每组三个重复。并以不接种的培养基作空白对照。28℃静止培养42天后，培养液4℃下5000g 离心15分钟，格利斯试剂法比色测定上清液中的亚硝酸盐浓度。
将本专利权利要求1与附件1公开的技术方案相比，存在以下区别技术特征：
1）所需3种试剂的制备方法略有不同：
a. 牛肉膏-蛋白胨培养基的制备：①牛肉膏及蛋白胨用量不同且本专利权利要求1中增加了5g NaCl的组分；②权利要求1的牛肉膏-蛋白胨培养基在加入琼脂之前增加了一次高温高压灭菌的步骤，附件1中没有公开灭菌的方法以及具体参数；③培养基冷却后倾倒至平板的温度不同；
b. 氨氧化能力鉴定培养液的制备：氨氧化能力鉴定培养液的组分中本专利权利要求1中有机碳源采用葡萄糖，无机组分中增加了NaCl和CaCO3，去掉了MnSO4和NaH2PO4；
c. 格利斯试剂的配制：对氨基苯磺酸以及α-萘胺醋酸溶液的浓度略有不同；
2）混合微生物菌群的稀释、涂布和细菌的纯化分离步骤的具体操作条件存在差异：
a. 混合微生物菌群的稀释步骤中，权利要求1共稀释10次，附件1未公开稀释次数；
b. 混合微生物菌群的涂布步骤中，附件1未公开取稀释样品的量，附件1中的培养温度较权利要求1低2℃；
c. 细菌的纯化分离步骤中，权利要求1为稀释平板纯化法，附件1为划线纯化法，且附件1未公开挑选孤立菌落以及在培养皿上形成孤立菌落的数目，且培养温度较权利要求1低2℃；
3）液体纯培养的硝化活性验证步骤中，权利要求1省略了在PM平板上初筛的步骤，此外，在氨氧化能力鉴定培养液中的筛查过程中，本专利权利要求1在30℃条件下培养细菌7-10天，培养期间每隔3天取2mL培养液至洁净试管，将格利斯试剂1-2滴直接点滴入试管中进行硝化活性确认；而附件1在28℃静止培养细菌42天，培养液4℃下5000g离心15分钟，格利斯试剂法比色测定上清液中的亚硝酸盐浓度。
根据上述区别技术特征以及本专利说明书的记载（参见说明书第3页第3段），本专利实际解决的技术问题在于提供一种新的分离筛选异养消化细菌的方法，简化实验操作步骤，降低实验试剂中杂质对实验结果的干扰，提高捡出率。
对于上述区别技术特征1)，本领域技术人员公知，在分离鉴定纯化异养硝化微生物时，牛肉膏-蛋白胨培养基、NB液体培养基（氨氧化能力鉴定培养液）、格利斯试剂是必需的3种试剂。其中向牛肉膏-蛋白胨培养基中加入NaCl为培养细菌提供无机盐是本领域的常规做法；附件2中公开了一种铵氮废水的生物脱氮方法及其微生物，其中公开了采用葡萄糖作为有机碳源的NB液体培养基（参见附件2说明书第13页倒数第9行），而且本领域技术人员也能够根据一般的技术常识对异养硝化细菌培养液中的无机成分进行适当增减。此外，本领域技术人员公知对配制好的牛肉膏-蛋白胨培养基必须要进行灭菌操作；至于灭菌方法的具体操作、以及培养基冷却后倾倒至平板的温度、格利斯试剂的配制中对氨基苯磺酸以及α-萘胺醋酸溶液的浓度本领域技术人员可以根据其掌握的技术知识进行适当调整，无需花费创造性劳动；
对于上述区别技术特征2)，本领域技术人员可以根据其掌握的常规技术知识得到混合微生物菌群的稀释、涂布步骤中存在的未公开的稀释次数、取稀释样品的量并适当调整培养温度的差异，无需花费创造性劳动；细菌的纯化分离步骤中，稀释平板纯化法与划线纯化法均为纯化分离细菌的常规方法，而挑选孤立菌落以及在培养皿上形成孤立菌落的数目是细菌纯化分离的常规必备步骤；此外，权利要求1中的培养温度虽然较附件1中高2℃，但也在常规的培养温度范围内，本领域技术人员通过有限次实验就可以得到这一培养条件，无需花费创造性劳动；
对于上述区别技术特征3)，在附件1中己公开了将PM平板划线纯化且格利斯试剂直接点滴呈阳性的菌株（初筛）接入NB液体培养基培养和活性验证的方法（复筛），本领域技术人员为了简化操作步骤，很容易想到将分离纯化的待检菌直接通过液体纯培养进行硝化活性验证。关于在鉴定中实验方法的差异，附件3中公开了异养硝化细菌、其培养方法及以应用。其中对液体纯培养基在不同培养时间和温度下亚硝酸盐的积累进行了描述（参见附件3第13页－第15页表7.5、图2-4）。在附件3的教导下，本领域技术人员可以预期对硝化细菌的培养温度、培养时间进行适当的微小改变也能进行菌株硝化活性的鉴定。
综上所述，本专利权利要求1与附件1在参数和步骤方面的区别技术特征均已被附件2、3公开或为本领域分离筛选异养硝化细菌的常规技术手段，而且权利要求1的技术方案也没有取得预料不到的技术效果。因此，当面对权利要求1实际要解决的技术问题时，本领域技术人员在附件1公开的技术方案的基础上，结合附件2、3及本领域的技术常识，得到权利要求1的技术方案是显而易见的。权利要求1相对于附件1、2、3和本领域技术常识的结合不具备突出的实质性特点，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
（六）关于其它问题
鉴于依据以上事实已经得出本专利全部权利要求不符合专利法第22条第3款规定的结论，故合议组对请求人所主张的本专利不符合专利法第26条第3款规定的无效理由不再予以评述。
基于以上事实和理由，本案合议组作出如下审查决定。
决定
宣告第200510030456.3号发明专利权全部无效。
当事人对本决定不服的，可以根据专利法第46条第2款的规定，自收到本决定之日起三个月内向北京市第一中级人民法院起诉。根据该款的规定，一方当事人起诉后，另一方当事人作为第三人参加诉讼。
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