发明创造名称：一种荧光定量聚合酶链式反应方法及其试剂盒
外观设计名称：
决定号：15373
决定日：2010-09-26
委内编号：4W100134
优先权日：
申请（专利）号：99100669.0
申请日：1999-02-12
复审请求人：
无效请求人：王虹
授权公告日：2002-11-13
审定公告日：
专利权人：中山大学达安基因股份有限公司
主审员：
合议组组长：吴通义
参审员：邹凯
国际分类号：C12Q 1/68;G01N 33/50
外观设计分类号：
法律依据：专利法第26条第3款
决定要点：在无效宣告请求程序中，请求人请求用非专利文献主张某专利不具有新颖性和创造性时，请求人必须证明该文献具有真实性，否则请求人应当承担其无效理由不能成立的法律后果。如果本领域普通技术人员根据说明书的记载，并依据本领域的普通技术知识能够实现说明书中所述的技术方案，解决其技术问题，并且能够产生预期的技术效果，那么该专利的说明书是公开充分的。
全文：
一、案由
本专利权无效宣告请求案涉及国家知识产权局于2002年11月13日公告授予的、名称为“一种荧光定量聚合酶链式反应方法及其试剂盒”的第99100669.0 号发明专利权（下称本专利），其申请日为1999年02月12日，专利权人为中山大学达安基因股份有限公司。本专利授权公告时的权利要求书如下：
“1.一种荧光定量聚合酶链式反应方法，包括以下步骤：
a、根据待检测靶基因的特异性核酸序列合成一对引物；
b、根据待检测靶基因的特异性核酸序列中位于两个引物之间的序列设计、合成一个荧光探针；
c、使用步骤a中的引物和步骤b中的荧光探针及其它聚合酶链式反应成份组成荧光聚合酶链式反应体系，其中镁离子的浓度为15-20mM,Taq酶用量为8-10单位/反应；
d、从待测标本中提取DNA，或是提取RNA然后逆转录成cDNA，加入步骤c中的反应体系中，经离心混合后测定反应前荧光值；
e、将反应管放入聚合酶链式反应仪进行20～50次循环的聚合酶链式反应；反应结束后再测定一次反应管中的荧光值；前后两次测值的差值即代表了本管反应的荧光增值；
f、同时用系列阳性和阴性模板也进行步骤d的核酸提取和聚合酶链式反应，测得各自相应的荧光增值，将荧光增值相对于阳性模板的初始核酸量的自然对数值作图，制成标准曲线；
g、用上述e步骤中获得的各样品的荧光增值，可在标准曲线上查出相应的样品中的核酸起始拷贝数。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中所述的两个引物之间相距50～500个碱基。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤e中所述的聚合酶链式反应进行30～50个循环。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤e中所述的聚合酶链式反应进行40个循环。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中所述的引物的长度是16～25个碱基。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中所述的荧光探针的长度是18～35个碱基。
7.一种用于荧光定量聚合酶链式反应方法的试剂盒，它包括DNA聚合酶，荧光聚合酶链式反应液，阳性模板，阴性模板，以及根据待测核酸的特异性核酸序列设计的聚合酶链式反应引物和荧光引物，其特征在于，该荧光聚合酶链式反应液中镁离子的终浓度为15-20mM,Taq酶用量为8-10单位/反应。
8.按照权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的待测核酸为淋球菌DNA，所述的特异性核酸序列为：
1 GCTACGCATA CCCGCGTTGC TTTGCTGTTC TCGACTGGGC AATTTTCCAG
51 TGTCAAACCT TTGGTCTTGG TTTCCAACAG GTCTAGGGTG CGCTCTGCTT
101 CGGCTCTCTG CTGTTTCAAG TCGTCCAGCT CGTTCTTGAC GCTCCATATC
151 GCTATGAACA GCCCTGCTAT GACTATCAAC CCTGCCGCCG ATATACCTAG
201 CAAGCTCCAC AGATAGGGCT TGAATACTGC CTTGCTCATG CGTAACTGCC
251 GGGCGTTTAT ATCGGCGGTT ATTTTCTGCT CGCTTTGCTT CAATGCCTCG
301 TTGATATTTT TCCGTAACGT CTCTAAGTCT GCTTTCGTTT GTTGCTCTAT
351 GCTGGCGGCT TCGGTGCGTG ATGTCTGCTC GAAGGTCTTC G
9.按照权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物序列为：
引物1:5’GCT ACG CAT ACC CGC GTT GC 3’
引物2:5’CGA AGA CCT TCG AGC AGA CA 3’
10.按照权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的荧光探针的序列为：
5’CAA GTC GTC CAG CTC GTT CTT GAC 3’。
11.按照权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的待测核酸为乙肝病毒DNA，所述的特异性核酸序列为：
1 ATCCTGCTGC TATGCCTCAT CTTCTTGTTG GTTCTTCTGG ACTATCAAGG
51 TATGTTGCCC GTTTGTCCTC TAATTCCAGG TACTTCAACA ACCAGCACGG
101 GACCATGCAG AACCTGCACG ACTCCTGCTC AAGGAACCTC TATGTATCCC
151 TCCTGTTGCT GTACCAAACC TTCGGACGGA AATTGCACCT GTATTCCCAT
201 CCCATCATCT TGGGCTTTCG GAAAATTCCT ATGGCAGTGG GCCTCAGCCC
251 GTTTCTCCTG GCTCAGTTTA CTAGTGCCAT TTGTTCAGTG GTTCGTAGGG
301 CTTTCCCCCA CTGT
12.按照权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物序列为：
引物1:5’ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT 3’，
引物2:5’ACAGTGGGGGAAAGCCCTACGAA 3’。
13.按照权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述的荧光探针的序列为：
5’TGGCTAGTTTACTAGTGCCATTTG 3’。
14.按照权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的待测核酸为丙肝病毒DNA，所述的特异性核酸序列为：
1 CTTCACGCAG AAAGCGTCTA GCCATGGCGT TAGTATGAGT GTCGTGCAGC
51 CTCCAGGACC CCCCCTCCCG GGAGAGCCAT AGTGGTCTGC GGAACCGGTG
101 AGTACACCGG AATTGCCAGG ACGACCGGGT CCTTTCTTGG ATCAACCCGC
151 TCAATGCCTG GAGATTTGGG CGTGCCCCCG CGAGACTGCT AGCCGAGTAG
201 TGTTGGGTCG CGAAAGGCCT TGTGGTACTG CCTGATAGGG TGCTTGCGAG
251 TGCCCCGGGA GGTCTCGTAG A
15.按照权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物序列为：
引物1:5’CTTCACGCAGAAAGCGTCTAGC，
引物2:5’TCTACGAGACCTCCCGGGGCAC。
16.按照权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述的荧光探针的序列为：
5’GAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAAC。
17.按照权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的待测核酸为沙眼衣原体DNA，所述的特异性核酸序列为：
1 CGATGATTTG AGCGTGTGTA GCGCTGAAGA AAATTTGAGC AATTTCATTT
51 TCCGCTCGTT TAATGAGTAC AATGAAAATC CATTGCGTAG ATCTCCGTTT
101 CTATTGCTTG AGCGTATAAA GGGAAGGCTT GATAGTGCTA TAGCAAAGAC
151 TTTTTCTATT CGCAGCGCTA GAGGCCGGTC TATTTATGATAT ATATTCTCAC
201 AGTCAGAAAT TGGAGTGCTG GCTCGTAT
18.按照权利要求17所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物序列为：
引物1:5’CGA TGA TTT GAG CGT GTG TAG CG 3’，
引物2:5’ATA CGA GCC AGC ACT CCA ATT TC 3’
19.按照权利要求17所述的试剂盒，其特征在于，所述的荧光探针的序列为：
5’TGA GCA ATT TCA TTT TCC GCT CG 3’。
20.按照权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的待测核酸为解脲支原体DNA，所述的特异性核酸序列为：
1 TTTATAAGGA GATAATGATT ATATGTCAGG ATCATCAAAT CAATTCACTC
51 CAGGTAAATT AGTACCAGGA GCAATTAACT TCGCTGAAGG CGAAAATGTG
101 ATGAACGAAG GTAGAGAAGC AAAAGTAATC AGCATTAAAA ATACTGGTGA
151 CCGTCCTATC CAAGTTGGAT CACATTTGCA CTTATTTGAA ACAAATAGTG
201 CATTAGTATT CTTTGATGAA AAAGGAAACG AAGACAAAGA ACGTAAAGTT
251 GCTTATGGAC GTCGTTTCGA TATTCTC。
21.按照权利要求20所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物序列为：
引物1:5’TTATAAGGAGATAATGATTATGTG，
引物2:5’GAGAATATCGAAACGACGTCCAT。
22.按照权利要求20所述的试剂盒，其特征在于，所述的荧光探针的序列为：
5’GGTAGAGAAGCAAAAGTAATCAGCA。
23.按照权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的待测核酸为结核杆菌DNA，所述的特异性核酸序列为：
1 TCGCCCGTCT ACTTGGTGTT GCTGCGCGGA GACGGTGCGT AAGTGGGTGC
51 GCCAGGCGCA GGTCGATGCC GGCGCACGGC CCGGGACCAC GACCGAAGAA
101 TCCGCTGAGA TAAAGCGCTT GCGGCGGGAC AACGCCGAAT TGCGAAGGGC
151 GAACGCGATT TTAAAGACCG CGTCGGCTTT CTTCGCGGCC GAGCTCGACC
201 GGCCAGCACG CTAATTACCC GGTTCATCGC CGATCATCAG GGCCACCGCG
251 AGGGCCCCGA TGGTTTGCGG TGGGGTGTCG AGTCGATCTG CACACAGCTG
301 ACCGAGCTGG GTGTGCCGAT CGCCCCATCG ACCTACTACG ACCACATCA
24.按照权利要求23所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物序列为：
引物1:5’TCGCCCGTCTACTTGGTGTT 3’，
引物2:5’TGATGTGGTCGTAGTAGGTC 3’
25.按照权利要求23所述的试剂盒，其特征在于，所述的荧光探针的序列为：
5’ACA ACG CCG AAT TGC GAA GGG C 3’”
请求人于2010年01月16日向专利复审委员会提出了无效宣告请求，同时提交了如下证据：
证据1：Kenneth J. Livak等，0ligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization，PCR Methods and Applications，第4卷，1995年，第357-362页，复印件共6页及其部分中文译文共2页；
证据2：标题为“第三节 PCR反应条件的优化”的图书第32-33页，复印件共2页；
证据3：标题为“中山大学达安基因股份有限公司乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）在国家食品药品监督管理局注册的信息”的打印件，共1页；
证据4：标题为“中山大学达安基因股份有限公司乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）在国家食品药品监督管理局注册的信息”的打印件，共1页；
证据5：张丽，高恩明，“国产乙型肝炎病毒（HBV）核酸扩增（PCR）定量检测试剂盒技术现状介绍”，《中国实验诊断学》，第9卷第1期，第159-160页，2005年2月，复印件共2页；
证据6：标题为“乙型肝炎病毒核酸扩增（PCR）荧光定量检测试剂盒说明书”的打印件，共4页。
依据上述证据，请求人认为：（1）本专利的核心技术与证据1完全相同，均使用TaqMan探针，均在反应结束后进行检测，均可使用普通荧光检测仪器，均无需使用昂贵的实时定量荧光PCR系统。因此，本专利不符合专利法第22条第2款的规定。（2）本专利权利要求书与说明书中强调镁离子浓度为15-20mM，Taq酶用量为8-10单位/反应，但证据2已讲到PCR反应条件的优化应当包括Taq酶、镁离子、引物、dNTP、缓冲液、模板等方面。任何一个分子生物学技术领域内的普通技术人员都懂得在实验过程中需优化上述PCR反应组分，以得到最佳PCR反应效果，因此镁离子浓度和Taq酶用量的调整是公知常识。简单提高镁离子浓度和Taq酶浓度，并无突出的实质性特点和显著的进步，属于分子生物学技术领域内普通技术人员皆可做到的事情。故专利权人对镁离子浓度和Taq酶用量的调整不应视为具有创造性。此外，本专利与已发表的文献的另一差别在于检测数据的处理方法。本专利中荧光差值的计算方法为有模板阳性组反应后的荧光值减去反应前的荧光值。而文献中的荧光差值计算方法为有模板阳性组反应后的荧光值减去无模板对照组反应后的荧光值。即，本专利将文献中的空白对照（背景）做了简单的更换，但这种更换极易推知，也属公知常识。故该专利的数据处理方法与文献报道虽有略差别，但亦无突出的实质性特点和显著的进步，不应视为具有创造性。（3）说明书不符合专利法第26条第3款的规定，具体理由在于：（a）本专利说明书第4页第6段描述该发明可定量的核酸起始拷贝数范围为1-1011拷贝／m1；第8页第2段描述：“使用本试剂盒的有益效果是，可以准确、快速、特异、方便地检测出临床疾病相关的特异性核酸序列。准确定量范围为0-109拷贝／m1，误差＜300％。”也就是说早在1999年专利权人即拥有了可将准确定量范围做到0-109拷贝／ml的乙肝病毒PCR定量检测技术。但是，证据3表明专利权人迄今为止生产的定性试剂盒――乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒（PCR－荧光探针法）的的检测下限（灵敏度）仅为103拷贝／m1。证据4表明专利权人生产的定量试剂盒――乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（PCR－荧光探针法）的定量范围是1×104-1×107拷贝／m1。与本专利说明书中表述的准确定量范围差距甚远。（b）目前国内外所有的乙肝病毒PCR定量检测技术，没有一例能达到0拷贝的定量下限。证据5表明由中国药品生物制品检定所制备、定值的HBV DNA定量线性参考品最低浓度为3.9×101，并且该浓度并不准确。证据5中同时提到，当时国内外试剂盒的灵敏度为104拷贝/ml，测定范围为104-108拷贝／m1，也就是说目前没有一种方法定量可以做到0拷贝的定量下限。（c）证据6表明目前国内同类产品的检测灵敏度亦仅为1×103拷贝／ml。0-109拷贝／ml的准确定量范围是本专利最重要的技术指标，也是证明本专利优于以前所有已报道技术的关键，但所属领域技术人员不能根据其说明书，在镁离子浓度为15-20mM，Taq酶用量为8-10单位／反应的条件下，将准确定量范围做到0-109拷贝／ml，因此本专利说明书没有对发明作出清楚、完整的说明。
经形式审查合格，专利复审委员会于2010年05月19日受理了上述无效宣告请求，并将无效宣告请求书及证据副本转送给了专利权人，同时成立合议组对本案进行审查。
针对上述无效宣告请求书，专利权人于2010年07月05日提交了意见陈述书及以下反证：
反证1：Kenneth J. Livak等，0ligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization， PCR Methods and Applications，第4卷，1995年，第357-362页，复印件6页及其部分中文译文6页；
反证2：公开号为US5538848 A的美国专利申请说明书，公开日为1996年7月23日，复印件10页及其部分中文译文3页；
反证3：Paul L. Crotty等，Quantitative analysis in molecular diagnostiscs，Human pathology，第25卷第6期，1994年6月，第572-579页，复印件8页及其部分中文译文1页；
反证4：Roman Jung等，Quantitative PCR，Clin Chem Lab Med，第38卷第9期，2000年，第833-836页，复印件4页及其部分中文译文1页；
反证5：Pamela M. Holland等，Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5’→3’ exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase，Proc. Natl. Acad. Sci.USA，第88卷，1991年8月，第7276-7280页，复印件5页及其部分中文译文1页；
反证6：标题为“国家食品药品监督管理局医疗器械技术审评中心----指导原则”的网页打印件，2页以及标题为“体外诊断试剂生产及质量控制技术指导原则----核酸扩增法试剂生产及质量控制技术指导原则（报批稿）”的打印件，3页；
反证7：国家食品药品监督管理局第2006S06858号药品注册批件首页及第6-7页，复印件共3页；
反证8：国家食品药品监督管理局第2006S04818号药品注册批件，复印件共3页；
反证9：国家食品药品监督管理局第2004S02102号药品注册批件，复印件共3页；
反证10：标题为“第三节 PCR反应条件的优化”的图书第32-33页，复印件共2页，即请求人所提交的证据2。
专利权人在意见陈述书中认为：（1）权利要求1-25相对于证据1具备新颖性。请求人提供的证据1的题目译文和第357页第2纵列第1-32行内容的译文是不准确的，相应的译文见反证1。证据1所要解决的技术问题是探讨荧光素报告物和罗丹明淬灭物之间的距离，其采用是常规的PCR方法，其中所用的镁离子浓度为0-10mM，所用的Taq酶的浓度为1.25单位。而本专利所解决的技术问题是定量待检样品中特异性核酸（即起始模板）的含量，其采用的技术手段在于通过改进荧光定量PCR方法中特定检测引物和荧光探针的选用，以及PCR反应体系中增加Mg 的浓度和Taq酶的用量，从而克服了已有PCR方法的缺陷，提供了一种改良的定量检测样品中所存在的核酸的方法，所解决的技术问题在于准确定量平台期待检样品中特异性核酸（即起始模板）的含量。同时，涉及“镁离子”和“TaqDNA聚合酶”用量的技术特征是权利要求1、7与证据1的区别技术特征。因此权利要求1、7满足专利法第22条第2款关于新颖性的规定。在独立权利要求1和7相对于证据1具备新颖性的前提下，从属权利要求的权利要求2-6和8-25同样具备新颖性。(2)权利要求1-25相对于证据1和2而言具备创造性。首先，证据1所解决的技术问题完全不同于本专利所要解决的技术问题，证据1所要解决的技术问题是探讨荧光素报告物和罗丹明淬灭物之间的距离，其并未提及或暗示如何定量待检样品中特异性核酸（即起始模板）含量。而本专利所解决的技术问题是定量待检样品中特异性核酸（即起始模板）的含量，两者完全不同。反证3表明模板质量、dNTP和引物的最佳浓度、缓冲液组成，以及DNA聚合酶的活性和投入量等因素直接影响到PCR反应的效率。反证4表明PCR反应结束时特异性DNA产物的量与初始标本中靶序列的拷贝数并无直接关联。在医学和相关研究中需要定量标本中靶序列拷贝数的情况下，本领域急待解决如上讨论的这些问题。反证5表明为了解决上述问题，首先通过引物寡核营酸探针来通过利用Thermus aquaticus DNA聚合酶的5’→3’核酸外切酶活性来检测特异性聚合酶链式反应产物。反证2表明继后又出现了从不同角度对这一技术所进行的不同改进。Kenneth等人描述的改进的实时PCR方法主要是探针的改进，并且其中举例描述的也只是测定荧光增值，以证实荧光探针的效果，而基本上没有涉及和提示通过荧光增值计算原始PCR模板数。而本专利的发明点在于对镁离子和Taq酶用量的选择，所解决的技术问题在于解决准确定量平台期待检样品中特异性核酸的含量。其次，两者的技术手段也完全不同：证据1是采用常规的PCR方法，其中所用的镁离子浓度为0-10mM，所用的Taq酶的浓度为1.25单位。而本专利采用的是专利权人优化的PCR反应体系，其中所用的镁离子浓度为15-20mM，Taq酶用量为8-10单位/反应。证据1所述△RQ是由探针靶标的PCR扩增导致的报告物荧光增加的测量，并非是用于定量待检样品中特异性核酸的含量。而本专利是基于荧光PCR原理，通过绘制标准曲线，实现待检样品中特异性核酸含量的定量。证据1未对该检测计算方法提供任何的技术启示。此外，本专利要求保护的发明对于本领域的普通技术人员而言是非显而易见的，因为证据2虽然教导对于PCR反应而言，需要优化Taq酶和镁离子浓度，但其并未教导或暗示本专利的具体Taq酶和镁离子浓度，特别是并未公开或暗示对于解决本专利所要解决的上述具体技术问题而言，需要如何具体优化Taq酶和酶离子浓度，相反，证据2还暗示镁离子的用量高于6mM会出现非特异性扩增。同时，证据1没有对本领域的普通技术人员提供任何的技术启示使得本领域的普通技术人员来考虑增加Mg2 的浓度，特别是结合增加Taq DNA聚合酶的浓度来有效解决由于平台期而无法准确定量待检样品中特异性核酸（即起始模板）含量的问题。因此，即使本领域的普通技术人员在证据1的基础上，结合证据2，不会也不可能显而易见地获得用于解决本专利所要解决的技术问题所需要的Taq酶和镁离子浓度。（3）本专利的说明书符合专利法第26条第3款的规定。本专利的说明书实施例1检测了乙肝病毒，各个标本中PCR定量的平均拷贝数分别为1.1×108、2.8×107、8.6×105、2.3×105，即最高实现了108拷贝数的定量。关于本专利定量范围的0拷贝，本领域的普通技术人员显然理解当待检样品中并无模板特异性核酸时，检测结果为0拷贝，即对应于实施例1中的第（2）种情况（107例乙肝免疫指标全阴性的标本）。由此证明，本专利的实施例已充分证明了本专利的方法和试剂盒可以实现所述的准确定量范围。国内同类产品的检测灵敏度不同于本专利的定量范围并不能证明本专利不能实现所述定量范围。反证7-9表明“误差＜300％”是本领域可以允许的误差范围。
专利复审委员会本案合议组于2010年07月22日向双方当事人发出了口头审理通知书，定于2010年08月25日举行口头审理，同时将专利权人于2010年07月05日提交的意见陈述书及反证的副本转送给请求人。
2010年08月25日，口头审理如期举行。请求人本人、双方当事人委托的代理人参加了口头审理。双方当事人对对方出庭人员的身份和资格均无异议，对合议组成员无回避请求。请求人当庭提交了代理词。合议组对本案无效的理由和证据逐一进行了调查，双方当事人充分陈述了意见。在口头审理过程中，认定的事实如下：（1）请求人明确其请求宣告本专利无效的理由为本专利权利要求1-25相对于证据1不符合专利法第22条第2款的规定；权利要求1-25相对于证据1和证据2的结合不符合专利法第22条第3款的规定；本专利说明书不符合专利法第26条第3款的规定，依据证据3-6。（2）专利权人对证据1的真实性、关联性和译文准确性均不认可；对证据2、5的真实性和关联性不认可，并认为证据5的公开时间晚于本专利的申请日；对证据3-4的真实性、合法性和关联性均没有异议，但对其公开时间有异议；对证据6的真实性、合法性和关联性均不认可，同时对其公开时间有异议。（3）专利权人当庭提交了加盖国家图书馆公章的反证3-5的原件，并声明反证1和10是根据请求人提交的证据1和2所得到的，只有在证据1和2的真实性成立的条件下，才使用反证1和10；如果证据1、2的真实性无法得到认可，则不使用反证1和10。请求人对反证2-5的真实性、合法性、关联性和公开时间均没有异议；对反证6-9的真实性、合法性均没有异议，不认可其关联性。
至此，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
1. 法律适用
本专利的申请日在2009年10月1日之前，根据《施行修改后的专利法的过渡办法》，本案适用2000年8月25日第二次修正的专利法第22条第2款、第22条第3款和2009年10月1日第三次修正的专利法第26条第3款。
2.审查文本
本案中，专利权人未对授权公告文本进行修改。因此，本无效决定依据的审查文本是本专利的授权公告文本。
3.无效宣告请求的理由和范围
基于双方当事人的书面意见以及口头审理过程中的陈述，合议组确认本案审查的无效理由和范围为：（1）本专利权利要求1-25相对于证据1不符合专利法第22条第2款的规定；（2）权利要求1-25相对于证据1和证据2的结合不符合专利法第22条第3款的规定；（3）针对权利要求1-25，本专利说明书不符合专利法第26条第3款的规定，所依据的证据为证据3-6。
4.证据的认定
证据1、2、5均为非专利文献的复印件，证据6是标题为“乙型肝炎病毒核酸扩增（PCR）荧光定量检测试剂盒说明书”的打印件。由于专利权人对证据1、2、5和6的真实性提出异议，请求人没有提交证据1、2、5和6的原件，也没有提交能够证明上述证据真实性的其他证据，合议组无法确认证据1、2、5和6的真实性。
专利权人对证据3-4的真实性、合法性和关联性均没有异议，合议组对此予以确认。专利权人对证据3-4的公开时间有异议，对此，合议组认为：请求人使用证据3和4的目的是为了证明中山大学达安基因股份有限公司迄今为止生产的定性试剂盒的定量范围与本专利说明书所述0-109拷贝／m1的准确定量范围差距甚远，而并非以其作为现有技术证据，因此证据3和4的公开时间是否在本专利的申请日之前并不影响其作为本案的证据使用。
反证8为一份国家食品药品监督管理局的药品注册批件，请求人对反证8的真实性、合法性均没有异议，合议组对此予以确认。
5.关于专利法第22条第2款和第22条第3款
在无效宣告请求程序中，请求人请求用非专利文献主张某专利不具有新颖性和创造性时，请求人必须证明该文献具有真实性，否则该文献不能作为评价该专利不具有新颖性和创造性的对比文件，请求人应当承担其无效理由不能成立的法律后果。
就本案而言，无效请求人请求用证据1作为现有技术以证明本专利不具有新颖性，同时用证据1和2结合以证明本专利不具有创造性。由于证据1和2的真实性存疑，无法确认其为本专利申请日前的现有技术，合议组对于请求人提出的本专利不具有新颖性和创造性的无效理由不予支持。
6.关于专利法第26条第3款
专利法第26条第3款规定，说明书应当对发明或者实用新型作出清楚、完整的说明，以所属技术领域的技术人员能够实现为准。
如果本领域普通技术人员根据说明书的记载，并依据本领域的普通技术知识能够实现说明书中所述的技术方案，解决其技术问题，并且能够产生预期的技术效果，那么该专利的说明书是公开充分的。
就本案而言，本专利要求保护一种荧光定量聚合酶链式反应方法及其试剂盒。本专利所要解决的技术问题在于提供一种简便、价廉、准确率高的定量荧光PCR检测方法以及用于该方法的试剂盒。
本专利说明书的实施例1公开了利用本发明的乙肝病毒荧光定量PCR诊断试剂盒进行检测的具体方案（参见说明书第9-11页），其中详细记载了试剂盒的组成，具体的检测步骤，检测结果表明检出的阳性率达到58.3％，用于大三阳诊断的假阴性率为0，用于乙肝免疫指标诊断的假阳性率为0，用于小三阳诊断的阳性率为73％，用于针对不同表面抗原的大三阳诊断的PCR定量检测出的平均拷贝数分别为1.1×108、2.8×107、8.6×105、2.3×105。在口头审理的过程中，请求人对于本发明的试剂盒能够检测出平均拷贝数分别为1.1×108、2.8×107、8.6×105、2.3×105乙肝病毒的技术效果也予以认可。本领域技术人员按照说明书中公开的上述内容能够制备出本发明要求保护的试剂盒，利用该试剂盒也能够实施定量检测平均拷贝数大约为105-108的乙肝病毒的技术效果。由此可见，本领域普通技术人员根据本专利说明书的记载，能够实现说明书中所述的技术方案，解决其技术问题，并且能够产生预期的技术效果，因此，本专利的说明书满足充分公开的要求。
请求人在无效宣告请求书中强调，证据3表明专利权人迄今为止生产的定性试剂盒――乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒的检测下限仅为103拷贝／m1；证据4表明专利权人生产的定量试剂盒――乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒的定量范围是1×104-1×107拷贝／m1。以上与本专利说明书记载的本专利试剂盒“准确定量范围为0-109拷贝／m1，误差＜300％”差距甚远，可见本领域技术人员不能根据本专利说明书实现其关键技术指标――准确定量0-109拷贝／m1范围。对此，合议组认为：证据3和证据4显示的是专利权人生产的两种乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒在国家食品药品监督管理局注册的信息，其中既未记载试剂盒的组分包含镁离子，也未记载Taq酶的用量。在口头审理过程中，请求人和专利权人也一致认定这两种试剂盒与本专利所要求保护的试剂盒不同，其相应的检测方法也与本专利所要求保护的检测方法不同。因此，证据3和证据4与与本专利的技术方案并无关联，不能证明本专利说明书不符合专利法第26条第3款的规定。
另外，请求人在无效宣告请求书中还请求用证据5和6作为证据来证明本专利说明书不符合专利法第26条第3款的规定，由于证据5和6的真实性无法确认，合议组对于请求人提出的相应无效理由不予支持。
同时，请求人在口头审理过程中还强调：（1）本专利说明书中的实施例1没有任何证据说明是采用本专利反应体系进行检测而获得的检测结果；（2）按照说明书的描述，本专利的方法可以检测出1ml样品中含有的1拷贝模板，由于PCR体系中模板的加入量不能超过反应体系的十分之一，因此无法保证十分之一量的溶液中一定含有1拷贝的模板；（3）根据说明书的记载，遇到阴性结果，不参加定量结果的统计，由于检测样品含量在灵敏度以下即为阴性样本，而反证8中记载的检测标准是2.5×103-4×104／ml，即灵敏度仅能达到103／ml标准，因此0-103拷贝／ml含量的样品的检测结果是阴性，即0-103拷贝／ml的范围不能定量，定量范围显然不能从“0”开始；（4）本专利说明书对于定量范围的两处表述：“可定量的核酸起始拷贝数范围为1-1011拷贝／ml。可定量的核酸起始拷贝数较好的范围为103-109拷贝／ml”与“准确定量范围为0-109拷贝／毫升，误差＜300%”自相矛盾。基于以上理由，本专利的说明书公开不充分，不符合专利法第26条第3款的规定。
对此，合议组认为：（1）如前所述，本专利说明书的实施例1正是采用本专利所述的技术方案来实施的，其公开的实验数据已能够充分证实本发明所述的技术效果，使本领域技术人员确信本专利能够解决前述所要解决的技术问题。（2）如上所述，本专利说明书的实施例1所提供的实验数据已经证明本专利的方法可以检测出平均拷贝数大约为105-108的乙肝病毒，这已经证明本申请的说明书是充分公开的，本专利的方法是否可以检测出1ml样品中含有1拷贝模板的样品对这一结论没有影响。（3）反证8是国家食品药品监督管理局的药品注册批件，其中既未记载试剂盒的组分包含镁离子，也未记载Taq酶的用量。请求人在口头审理过程中也承认反证8的试剂盒与本专利所要求保护的试剂盒不同，因此反证8不能证明本专利说明书不符合专利法第26条第3款的规定。（4）本专利说明书记载了不同的定量范围“1-1011拷贝／ml”、“103-109拷贝／ml”与“准确定量范围为0-109拷贝／毫升”，这些定量范围都是本专利记载的本专利技术方案可选择的定量范围，各范围之间并无矛盾之处。故合议组对请求人所主张的上述无效理由不予支持。
基于以上事实和理由，本案合议组作出如下审查决定。
三、决定
维持第99100669.0号发明专利权有效。
当事人对本决定不服的，可以根据专利法第46条第2款的规定，自收到本决定之日起三个月内向北京市第一中级人民法院起诉。根据该款的规定，一方当事人起诉后，另一方当事人作为第三人参加诉讼。
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