发明创造名称：新的赖氨酸脱羧酶基因以及生产L-赖氨酸的方法
外观设计名称：
决定号：15463
决定日：2010-09-27
委内编号：4W02307
优先权日：
申请（专利）号：95197577.3
申请日：
复审请求人：
无效请求人：长春大合生物技术开发有限公司
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：味之素株式会社
主审员：
合议组组长：李金光
参审员：吴通义
国际分类号：C12N 15/00，C12N 9/88
外观设计分类号：
法律依据：专利法第26条第3;4款，专利法第22条第3款
决定要点：权利要求书应当以说明书为依据，是指权利要求书应当得到说明书的支持。权利要求书中的每一项权利要求所要求保护的技术方案应当是所属技术领域的技术人员能够从说明书中公开的内容得到或者概括得出的技术方案，并且不得超出说明书公开的范围。如果权利要求的概括包含申请人推测的内容，而其效果又难于预先确定和评价，应当认为这种概括超出了说明书公开的范围，该权利要求得不到说明书的支持。反之，则该权利要求得到了说明书的支持。
全文：
一、案由
本专利权无效宣告请求案涉及国家知识产权局于2007年12月26日公告授予的、名称为“新的赖氨酸脱羧酶基因以及生产L－赖氨酸的方法”的第95197577.3号发明专利权（下称本专利），其申请日为1995年12月5日，优先权日为1994年12月9日，专利权人为味之素株式会社。本专利授权公告的权利要求书如下:
“1.一种编码赖氨酸脱羧酶的基因，它具有序列表中SEQ ID NO：4给出的氨基酸序列。
2.权利要求1中的基因，其中该基因具有序列表中SEQ ID NO：3的第1005至3143位密码的核苷酸序列。
3.权利要求1的基因，其中所述氨基酸序列具有一个或多个氨基酸残基替换、缺失或插入，但基本上没有任何赖氨酸脱羧酶活性的退化。
4.一种埃希氏杆菌属的微生物，它具有L-赖氨酸生产能力，并且其细胞内赖氨酸脱羧酶活性降低或消失，其中细胞内赖氨酸脱羧酶活性通过权利要求1-3任一项中限定的基因和/或cadA基因的表达受限而降低或消失。
5.权利要求4的微生物，其中所述微生物是大肠杆菌。
6.权利要求4或5中的微生物，其中基因的表达由于权利要求1～3中任一权项的基因和/或cadA基因受到破坏而受限制。
7.权利要求4或5中的微生物，其中权利要求1～3中任一权项限定的基因和/或cadA基因由于其核酸序列中一个或多个核苷酸的替换、缺失、插入、添加或倒位而被破坏。
8.一种产L-赖氨酸的方法，其包括在液体培养基中培养一种有L-赖氨酸生产能力的埃希氏杆菌属微生物的步骤，该微生物的细胞内赖氨酸脱羧酶活性降低或消失，以便生产L-赖氨酸并在液体培养基中累积，并收集L-赖氨酸。
9.权利要求8的方法，其中通过限制权利要求1-3中任一权项限定的基因和/或cadA基因的表达而使细胞内赖氨酸脱羧酶活性降低或消失。”
针对上述专利权，长春大合生物技术开发有限公司（下称请求人）于2008年9月22日向专利复审委员会提出专利权无效宣告请求，认为本专利不符合专利法第26条第3、4款和第22条第3款以及专利法实施细则第20条第1款的规定。同时提交了如下证据：
证据1：PUTRESCINE AND SPERMIDINE SENSITIVITY OF LYSINE DECARBOXYLASE IN ESCHERICHIA COLI: EVIDENCE FOR A CONSTITUTIVE ENZYME AND ITS MODE OF REGULATION, Stanley J. Wertheimer等人，BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, 第114卷，第2期，1983年7月29日，第882―888页，英文，复印件共7页，及其中文译文共2页。
证据2：Nuclleotide Sequence of the Escherichia coli cad Operon: a System for Neutralization of Low Extracellular pH, SHI-YUAN MENG等人，JOURNAL OF BACTERIOLOGY, 1992年4月，第2659―2669页，英文，复印件共11页，及其中文译文共3页。
证据3：美国专利文献US4346170，公开日为1982年8月24日，英文，复印件共4页，及其中文译文共2页。
请求人认为：
（1）关于专利法实施细则第20条第1款
本专利权利要求1将涉及的基因限定为“具有序列表中SEQ ID NO:4给出的氨基酸序列”，本领域已知基因是核酸序列，不可能具有氨基酸序列，因此权利要求1以及引用权利要求1的权利要求2、3保护范围不清楚；权利要求3中的词语“多个”、“基本上”、“活性的退化”以及“氨基酸残基替换、缺失或插入”的位置均不清楚，本领域技术人员无法确定哪些氨基酸残基的替换、缺失或插入“基本上没有任何赖氨酸脱羧酶活性的退化”，同时权利要求3与权利要求1实际上并不存在从属关系，因此引用关系也不正确；权利要求4中“表达受限”含义不清，无法确定如何受限以及受限程度，同时该权利要求没有微生物的分类命名和结构或组成来限定；权利要求5－7引用了不清楚的权利要求4，且权利要求7中的“一个或多个”以及“核苷酸替换、缺失、插入、添加或倒位”的表述均不清楚；权利要求8限定的微生物仅仅用该微生物的功能特征来限定；权利要求9引用了不清楚的权利要求8，同时“限制权利要求1-3中任一权项限定的基因和/或cadA基因的表达”含义不清。综上所述，权利要求1-9保护范围不清楚，不符合专利法实施细则第20条第1款的规定。
（2）关于专利法第26条第3款
本专利涉及公众不能得到的生物材料，但是专利权人却未按照专利法实施细则第25条的要求，在本专利的优先权日前将该微生物菌株提交国家知识产权局认可的保藏单位保藏，从说明书记载的保藏信息可以看出，专利权人于1995年9月29日将本专利涉及的菌株AJ13068和AJ69（说明书中记载为AJ13069）送交国际保藏机构保藏（见说明书第10页倒数第4-7行、第11页第12－15行），晚于本专利的优先权日1994年12月9日，造成本专利说明书公开不充分，不符合专利法第26条第3款的规定。
（3）关于专利法第26条第4款
权利要求1要求保护的技术方案在说明书中没有记载；权利要求2限定的技术方案既具有序列表中SEQ ID NO：4给出的氨基酸序列，又具有序列表中SEQ ID NO:3的第1005至3143位密码的核苷酸序列，这一技术方案在说明书中找不到相应记载；权利要求3所述的具有一个或多个氨基酸残基替换、缺失或插入的氨基酸序列在说明书中没有实施例，且并未克服其引用权利要求1得不到说明书支持的缺陷；本专利说明书记载的微生物只有大肠杆菌AJ13068和AJ69两个菌株，且均未按照专利法实施细则的相关规定进行保藏，权利要求4涉及的微生物的概括范围过宽，同理，权利要求8以及引用权利要求4的权利要求5-7也同样得不到说明书的支持；权利要求7中限定的“一个或多个核苷酸的替换、缺失、插入、添加或倒位”在说明书实施例中缺少实验证据的支持；权利要求8、9中的“埃希氏杆菌属”限定的范围过宽；综上所述，本申请权利要求1-9均不符合专利法第26条第4款的规定。
（4）关于专利法第22条第3款
权利要求1－3涉及一种编码赖氨酸脱羧酶的基因，证据1公开了在一种大肠杆菌突变株中检测到赖氨酸脱羧酶活性，该酶是由ldc基因编码的，因此，现有技术已知除了cadA基因外，还存在另一种赖氨酸脱羧酶基因ldc。证据2公开了大肠杆菌赖氨酸脱羧酶的cadA基因的核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列，本领域技术人员如果要获得证据1中的ldc序列，很容易想到用证据2公开的cadA基因或其部分作为探针，在大肠杆菌的cDNA文库中进行常规的筛选，即可获得权利要求1和2要求保护的技术方案，权利要求1和2不具备创造性；此外本领域公知酶的氨基酸序列经过氨基酸残基替换、缺失或插入可能得到酶活性基本不变的变异体，因此权利要求3的附加技术特征也不能为其带来创造性。
权利要求4涉及一种埃希氏杆菌属的微生物，证据3公开了具有L－赖氨酸生产能力的埃希氏杆菌属微生物，权利要求4与其区别在于权利要求4细胞内的赖氨酸脱羧酶活性通过ldc基因和/或cadA基因的表达受限而降低或消失。由证据2可知，cadA基因在现有技术中是已知的，而且，本领域普通技术人员可以显而易见地获得ldc基因。为了提高埃希氏杆菌属微生物的赖氨酸产量，本领域技术人员容易想到通过常规基因工程方法，限制该微生物ldc基因和/或cadA基因的表达，从而使其赖氨酸脱羧酶活性降低或消失，从而减少L－赖氨酸的降解；权利要求5将权利要求4的微生物进一步限定为大肠杆菌，证据3已经公开了具有L－氨基酸生产能力的埃希氏杆菌属微生物可以是大肠杆菌；权利要求6限定权利要求4或5中基因的表达由于权利要求1－3中任一项限定的基因受到破坏而受到限制，但通过破坏某一基因而限制其表达是本领域的公知常识，而且破坏基因也只需要使用本领域的常规手段；权利要求7中的附加技术特征―在基因的核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸的替换、缺失、插入、添加或倒位等突变是本领域破坏基因的常规手段，因此，权利要求4-7不具备创造性。
权利要求8、9涉及一种生产L-赖氨酸的方法，证据3已经公开了为生产L－赖氨酸，在液体培养基中培养具有L赖氨酸生产能力的埃希氏杆菌属微生物，并在液体培养基中累积和收集L－赖氨酸。权利要求8与证据3的区别在于其中所使用的微生物的细胞内赖氨酸脱羧酶活性降低或消失。但本领域公知该酶会催化赖氨酸脱羧降解从而降低微生物的赖氨酸产量，因此本领域技术人员很容易想到通过使微生物细胞内的赖氨酸脱羧酶活性降低或消失来减少赖氨酸产物的降解，而要做到这一点也只需要采用常规的基因工程方法，限制该微生物ldc基因和/或cadA基因的表达，从而使其赖氨酸脱羧酶活性降低或消失，使L－赖氨酸降解减少，因此本领域技术人员能够显而易见地获得权利要求8、9所要求保护的方法，权利要求8、9不符合专利法第22条第3款的规定。
经形式审查合格后，专利复审委员会受理了上述请求，于2008年12月12日向双方当事人发出《无效宣告请求受理通知书》，并将《专利权无效宣告请求书》及其附件副本转送给专利权人，要求其在指定的期限内答复，同时成立合议组对本无效宣告请求案进行审理。
专利权人于2009年1月24日针对请求人的无效宣告请求书提交了意见陈述书、修改后的权利要求书（共1页）、证据1的译文更正（共2页）、证据2的补充译文（共1页）和以下反证：
反证1：Methods in Enzymology, 第211卷， David M.J. Lilley和James E. Dahlberg主编，1992年出版，封面页、扉页、出版信息页、目录页及第3―20页，英文，复印件共24页，中文译文2页以及文献复制证明1页。
反证2：微生物国际保藏证明材料，英文，复印件共13页，中文译文共4页。
反证3：Formation of a Compensatory Polyamine by Escherichia coli Polyamine-Requiring Mutants during Growth in the Absence of Polyamines, KAZUEI IGARASHI等人, Journal of Bacteriology，第166卷，第1期，1986年4月，封面页、扉页、目录页，第128－134页，英文，复印件共9页，中文译文3页。
反证4：Expression of the second lysine decarboxylase gene of Escherichia coli, Marc Lemonnier等人，Microbiology, 第144卷，1998年3月，封面页、目录页，第751－760页，英文，复印件共13页，中文译文3页。
反证5：专利文献WO9617930，公开日为1996年6月13日，日文，复印件共45页，及其中文译文共1页。
修改后的权利要求书如下：
“1.一种编码赖氨酸脱羧酶的基因，它具有序列表中SEQ ID NO：4给出的氨基酸序列。
2.权利要求1中的基因，其中该基因具有序列表中SEQ ID NO：3的第1005至3143位密码的核苷酸序列。
3.权利要求1的基因，其中所述氨基酸序列具有一个或多个氨基酸残基替换、缺失或插入，但基本上没有任何赖氨酸脱羧酶活性的退化。
4.一种埃希氏杆菌属的微生物，它具有L-赖氨酸生产能力，并且其细胞内赖氨酸脱羧酶活性降低或消失，其中细胞内赖氨酸脱羧酶活性通过权利要求1-3任一项中限定的基因的表达受限或通过cadA基因和权利要求1-3任一项中限定的基因的表达受限而降低或消失。
5.权利要求4的微生物，其中所述微生物是大肠杆菌。
6.权利要求4或5中的微生物，其中基因的表达由于权利要求1-3中任一权项的基因或cadA基因和权利要求1-3任一项的基因受到破坏而受限制。
7.权利要求4或5中的微生物，其中权利要求1-3中任一权项限定的基因或cadA基因和权利要求1-3任一项限定的基因由于其核酸序列中一个或多个核苷酸的替换、缺失、插入、添加或倒位而被破坏。
8.一种产L-赖氨酸的方法，其包括在液体培养基中培养一种有L-赖氨酸生产能力的埃希氏杆菌属微生物的步骤，该微生物的细胞内赖氨酸脱羧酶活性降低或消失，以便生产L-赖氨酸并在培养液中累积，并收集L-赖氨酸，
其中通过限制权利要求1-3中任一权项限定的基因的表达或限制cadA基因和权利要求1-3中任一权项限定的基因的表达使细胞内赖氨酸脱羧酶活性降低或消失。”
专利权人认为：
（1）关于专利法实施细则第20条第1款
本专利权利要求1要求保护一种编码赖氨酸脱羧酶的基因，本领域已知基因是核酸序列，其编码氨基酸序列，根据说明书第3页第8-9行的记载“这个基因编码的赖氨酸脱羧酶氨基酸序列在序列表SEQ ID NO: 4中给出”，本领域技术人员可以得出唯一合理的解释，即权利要求1是指所述基因编码SEQ ID NO: 4的氨基酸序列；权利要求2、3对权利要求1的核苷酸序列进行了更具体的限定，对本领域技术人员而言是清楚的；权利要求3中的词语“基本上”具有本领域中通常的含义，即修饰后的酶与修饰前的相比在酶活性的测定上没有实验学上有意义的降低，“活性的退化”包括活性完全消失和任何实验学上有意义的退化，此外根据说明书第3页第20－28行的说明，本领域技术人员清楚术语“氨基酸残基替换、缺失或插入”的意义和范围，且权利要求3中不涉及特定位点的氨基酸残基的修饰，因此氨基酸位点与权利要求是否清楚无关；权利要求4中“表达受限”指基因的表达与野生型菌株相比受到限制，表达量降低或不表达，至于如何达到表达受限的结果与权利要求是否清楚无关，同时该权利要求已经记载了微生物的分类名称，即埃希氏杆菌，也对该微生物的结构特征―赖氨酸脱羧酶及其基因进行了限定；权利要求5－7引用的权利要求4是清楚的，且权利要求7中的“一个或多个核苷酸的替换、缺失、插入、添加或倒位”也是清楚的；综上所述，修改后权利要求1-8保护范围是清楚的，符合专利法实施细则第20条第1款的规定。
（2）关于专利法第26条第3款
本专利说明书公开了ldc基因的核苷酸序列及其来源，一旦鉴定了一种基因的核苷酸序列，本领域技术人员就可以通过常规技术手段获得该基因。例如，通过合成的方法获得（参见反证1）或利用该基因的序列设计引物通过PCR方法从野生型大肠杆菌中分离（参见实施例1）。此外，本领域技术人员容易通过常规基因工程方法限制微生物中ldc基因和/或cadA基因的表达以及利用如此改造的微生物发酵生产L-赖氨酸，说明书第3-7页以及实施例中对此进行了详细说明，因此本专利的实施并不依赖于特定微生物菌株的保藏。另一方面，本专利进行了两个大肠杆菌菌株的保藏，符合专利法及其实施细则的有关规定（参见反证2）。需要说明的是，在本专利按照PCT进入中国国家阶段时，中国法律要求的微生物保藏日期为中国申请日或国际申请日，而并非必须在优先权日之前（参见1992年《专利法实施细则》第25条和《中国专利局令（第7条）》）。
（3）关于专利法第26条第4款
权利要求1的技术方案可以得到说明书的支持，具体参见说明书第3页第3段；权利要求2的附加技术特征参见说明书第3页第2段的记载；对于权利要求3的技术方案，本领域技术人员公知，一种酶的氨基酸序列中存在许多对酶活性非必需的氨基酸残基，这些氨基酸残基在不同的微生物菌种之间可以有所变化，因此可以预测对一个或多个氨基酸残基的修饰不会导致酶活性的退化；对于权利要求4的技术方案，本专利对说明书记载大肠杆菌AJ13068和AJ69两个菌株进行了符合相关规定的保藏，此外，本领域技术人员公知、说明书中也详细教导了限制赖氨酸脱羧酶基因的表达方法（见说明书第5、6页）；权利要求5-7引用的权利要求4可以得到说明书的支持，同时对于权利要求7中的附加技术特征“一个或多个核苷酸的替换、缺失、插入、添加或倒位”，本专利说明书的实施例1（4）以及附图2中给出了赖氨酸脱羧酶基因中核苷酸残基修饰的具体实例；权利要求8中的“埃希氏杆菌属”微生物用于L－赖氨酸的生产在现有技术中是已知的，本发明的技术方案在于使微生物细胞中赖氨酸脱羧酶活性降低而消失。本领域技术人员可以预测，对于具有赖氨酸生产能力并有ldc基因编码的赖氨酸脱羧酶活性的埃希氏杆菌属微生物均能用于实现该技术方案；综上所述，本申请权利要求1-8均符合专利法第26条第4款的规定。
（4）关于专利法第22条第3款
本专利权利要求1－3要求保护一种编码赖氨酸脱羧酶的基因。证据1中公开了在非诱导条件下的大肠杆菌中存在低水平的赖氨酸脱羧酶的活性，认定该活性来自一种“假定的”第二种赖氨酸脱羧酶（诱导型的第一种赖氨酸脱羧酶的存在是已知的），但证据1中并没有提供所述假定的第二种赖氨酸脱羧酶存在的证据，而且也没有排除这种“低水平赖氨酸脱羧酶活性”来自其他酶的合理怀疑，也没有解释其结果与Goldemberg先前报道的有关两种赖氨酸脱羧酶的热敏感性不同的矛盾。因此，本领域技术人员并不能依据证据1确认大肠杆菌中确实存在第二种赖氨酸脱羧酶。例如，反证3、4和5均对证据1的结果提出了异议，认为其中所述的活性实际上很可能来自鸟氨酸脱羧酶。在此基础上，本领域技术人员无法预期可以成功地获得编码第二种赖氨酸脱羧酶的基因。而证据2只是报道了大肠杆菌中的第一种赖氨酸脱羧酶的基因cadA。此外，Southern杂交技术通常用于已知序列的基因的基因组定位，但是如果将其用于寻找新的基因则存在许多随机因素，导致结果无法预料。实际上，证据2试图利用cadA基因的序列通过Southern杂交寻找第二种赖氨酸脱羧酶，但没有成功。可见，现有技术中并不存在采用已知的cadA基因寻找第二种赖氨酸脱羧酶的技术启示。证据1和2的结合无法破坏本专利权利要求1-3的创造性。
本专利权利要求4及其从属权利要求5-7均涉及一种具有L－赖氨酸生产能力的埃希氏杆菌微生物，其中均要求ldc基因的表达受到限制。权利要求8涉及一种利用具有L－赖氨酸生产能力的埃希氏杆菌微生物生产L－赖氨酸的方法，其中也要求限制ldc的表达，证据2和3都没有教导通过降低或消除赖氨酸脱羧酶的活性来提高L－赖氨酸的产量，更没有教导通过限制ldc基因的表达来实现。实际上现有技术并没有分离鉴定出ldc基因，甚至无法确定是否存在这样的基因，根本谈不上限制其表达来降低或消除赖氨酸脱羧酶的活性。
综上所述，请求人给出的证据均无法破坏本专利权利要求1-8的创造性。
2009年3月5日，专利复审委员会本案合议组向请求人发出转送文件通知书，将专利权人于2009年1月24日提交的意见陈述书以及相关附件副本转送给请求人。
请求人于2009年4月16日提交了意见陈述书和反证3的中文译文（复印件1页）。请求人认为专利权人的意见陈述不具备说服力，同时除了重申其在无效宣告请求书中的理由外，进一步陈述了以下意见：专利权人所引用的反证3与证据1分别来自两个不同实验室的研究工作，其实验条件不同，而且研究对象是不同的大肠杆菌，其研究结果不能简单地进行对比，不能简单地认为它们分离的是同样的酶，本领域技术人员不会相信反证3对证据1中实验结果的解释。因此，反证3并不能让本领域技术人员推翻证据1的结论。专利权人引用的反证4不是现有技术，不能用来评价本专利的创造性。证据2正是受到证据1的启示，开展了寻找第二种赖氨酸脱羧酶的初步工作，尽管这一初步尝试没有成功，但证据2仍然对证据1作出了肯定的评价，并指出只是其“初步的”杂交实验没有成功，表明作者实际上鼓励研究人员继续进行该项研究（见专利权人提供的证据2的中文译文）。因此，本领域技术人员不会将其失败的原因归结为大肠杆菌中根本不存在第二种赖氨酸脱羧酶，而只会认为是其实验条件不合适。对本领域技术人员而言，依据证据2公开的cadA基因序列设计引物，并设计相应的条件利用Southern杂交技术获得本专利的赖氨酸脱羧酶基因是常规技术，只需要少量的常规实验来确定，在证据1中已经确定第二种赖氨酸脱羧酶确实存在的前提下，这一杂交试验的最终结果完全是可以预料的。
2009年5月15日，本案合议组向双方当事人发出口头审理通知书，定于2009年7月7日对本案进行口头审理，同时将请求人于2009年4月16日提交的意见陈述书及其附件副本转送给专利权人，并要求其在指定的期限内答复。
口头审理于2009年7月7日如期进行，双方当事人均参加了口头审理。双方当事人对合议组成无回避请求，对对方出庭人员无异议。在口头审理过程中，合议组对请求人提出的无效宣告请求理由和事实逐一进行了调查，双方当事人充分陈述了各自的意见。口头审理中认定的事实如下：
（1）请求人对专利权人于2009年1月24日提交的权利要求书无异议;合议组合议后认为该修改的权利要求书符合审查指南的相关修改的规定，并当庭确认以该修改后的权利要求书作为审理的基础。（2）针对修改后的权利要求书，请求人确认其无效宣告请求的理由和范围是：本专利说明书未充分公开权利要求1－8的技术方案，不符合专利法第26条第3款的规定；权利要求1-8不符合专利法第26条第4款以及专利法实施细则第20条第1款的规定；权利要求1-3相对于证据1和2的结合（证据1为最接近的对比文件）、权利要求4-7相对于证据2和3的结合（证据3为最接近的对比文件）、权利要求8相对于证据3不符合专利法第22条第3款关于创造性的规定。（3）专利权人认可证据1、2的真实性、合法性和关联性，但不认可证据3的真实性。请求人对于反证1-5的真实性、合法性和关联性均没有异议，但认为反证2、4、5并非现有技术。请求人认可专利权人提交的反证1-4和证据1的中文译文以及证据2的补充中文译文的准确性，并当庭放弃了对反证3的中文译文的更正，但请求人认为专利权人提交的反证5为本专利的PCT国际公开文本，其中文译文应该以本专利的授权公告文本为准，因此不认可专利权人提交的反证5的中文译文的准确性。专利权人认可请求人提交的证据2、3中文译文的准确性。（4）合议组当庭告知双方当事人可以在口头审理结束后一周内提交针对口头审理调查内容的书面意见，但不接受新的理由和证据。
2009年7月14日，请求人针对口头审理的内容提交了意见陈述书。请求人认为：（1）本专利中所使用的微生物AJ13069是用化学诱变法获得的（见本专利说明书第5页倒数第3-7行、第9页第12-15行），属于通过不能再现的筛选、突变等手段新创的微生物菌种，因此必须进行保藏。（2）本专利说明书实施例1（4）及图2仅仅给出了通过替换对基因进行修饰的方法，并没有记载缺失、插入、添加或倒位的实例，因此权利要求7中限定的“一个或多个核苷酸的缺失、插入、添加或倒位”在说明书中缺少实验证据的支持，导致权利要求7不符合专利法第26条第4款的规定。（3）证据1中肯定了新的赖氨酸脱羧酶的存在。反证3也支持证据1关于存在不同于诱导型赖氨酸脱羧酶的组成型赖氨酸脱羧酶的观点，这种组成型赖氨酸脱羧酶就是反证3所述的赖氨酸脱羧酶2，而反证3至多怀疑赖氨酸脱羧酶1与鸟氨酸脱羧酶相同。反证4不是现有技术，不能用于评价本专利的创造性。而且实际上反证4也支持证据1的结论。反证5是本专利的PCT国际公开文本，在本专利进入国家阶段时提交了其中文文本，本专利授权公告的说明书与最初提交的中文文本说明书是一致的，其中第1页倒数第12行明确指出现有技术中已确定了第二种赖氨酸脱羧酶的存在，也就是说专利权人也承认证据1的结论。在证据1确认了第二种赖氨酸脱羧酶存在的情况下，证据1明确教导可以对所述酶进行纯化和表征，由于相同功能的酶通常在序列上也存在很大程度的同源性，技术人员会想到利用已知的cadA基因或其部分作为探针，在大肠杆菌cDNA文库中进行常规筛选，从而获得本专利的基因。证据2正是在证据1的教导下开展了寻找第二种赖氨酸脱羧酶的初步工作，通过Southern杂交用cadA探针探查大肠杆菌染色体DNA，尽管初步的杂交实验“在所用的条件下”并没有成功，但其仍然对证据1作出了肯定的评价，本领域技术人员会想到使用证据2的常规Southern杂交技术，通过常规实验找到更合适的实验条件，从而显而易见地获得本发明。（4）请求人认可专利权人提交的反证5的译文的字面含义与反证5的原文一致。
2009年7月14日，专利权人也针对口头审理的内容提交了意见陈述书。专利权人认为：（1）反证3发现两种赖氨酸脱羧酶活性，并确定其中LDC2是普通的诱导型赖氨酸脱羧酶，而另一种受腐胺抑制的LDC1来自鸟氨酸脱羧酶的活性。虽然请求人主张反证4不是现有技术不能用来评价本专利的创造性，但该证据反映了本领域技术人员对于现有技术的评价，并认为这些现有技术关于存在第二种赖氨酸脱羧酶的证据仍然是残缺和不确定的。（2）按照Southern杂交的方法成功分离新基因的前提是用来设计探针的已知基因的序列与待测基因序列具有足够高的同源性，请求人没有提供证据证明已知的cadA基因的序列与所谓第二种酶的基因序列之间具有高同源性。而且证据1中所谓的第二种酶与已知的酶在对腐胺和亚精胺敏感性等方面差别很大，在没有高同源性保证的下，利用cadA基因的探测只是去碰运气。因此即使假定本领域技术人员确认第二种赖氨酸脱羧酶存在，本领域技术人员也不会预期利用cadA基因序列可以获得第二种酶的基因。（3）此外，请求人对创造性的一些论述反驳了其关于本专利说明书不符合专利法第26条第3、4款的规定的主张。
至此，合议组认为本案事实已经清楚，可以依法作出审查决定。
二、决定的理由
（一）关于审查文本
在本案审查过程中，专利权人于2009年1月24日提交了修改后的权利要求书（共8项），请求人在口头审理中对其修改方式和提交时间均无异议。经审查，上述修改文本的修改之处在于将授权公告的权利要求4、6、7和9中的“权利要求1-3任一项限定的基因和/或cadA基因”修改为“权利要求1-3任一项限定的基因或cadA基因和权利要求1－3任一项限定的基因”，即从原权利要求限定的三个并列的技术方案中删除一个技术方案，这种修改符合专利法实施细则第68条第1款和《审查指南》第四部分第三章第4.6节的有关规定，因此，本无效宣告请求的审查文本为：专利权人于2009年1月24日提交的权利要求第1-8项、本专利授权公告的说明书及其序列表、附图和摘要。并且根据《审查指南》第四部分第三章第2.2节的规定，视为专利权人承认大于修改后的权利要求1－8的保护范围的权利要求自始不符合专利法及其实施细则的有关规定。
（二）关于法条适用
本专利的申请日在2009年10月1日之前，根据《施行修改后的专利法的过渡办法》和《施行修改后的专利法实施细则的过渡办法》，本案适用2000年8月25日第二次修正的专利法第22条第3款以及2008年12月27日第三次修正的专利法第26条第3、4款。
（三）无效宣告请求的理由、范围、证据及其译文
根据请求人在口头审理中的确认，其请求宣告本专利权无效的理由及其范围是：本专利说明书未充分公开权利要求1－8的技术方案，不符合专利法第26条第3款的规定；权利要求1-8不符合不符合专利法第26条第4款（原专利法第26条第4款以及专利法实施细则第20条第1款）的规定；权利要求1-3相对于证据1和2的结合、权利要求4-7相对于证据2和3的结合、权利要求8相对于证据3不符合原专利法第22条第3款关于创造性的规定。
证据1、2为科技文献，专利权人认可其真实性、合法性和关联性，合议组在此予以确认。证据3为专利文献，专利权人未认可其真实性，经核实，合议组认可证据3的真实性。证据1－3的公开日期均在本专利的优先权日之前，可用于评价本专利权利要求的创造性。
请求人认可专利权人提交的证据1、2的中文译文的准确性，专利权人认可请求人提交的证据2和3中文译文的准确性，合议组确认证据1的中文译文以专利权人提交的译文为准，证据2的译文以请求人提交的译文及专利权人提交的补充译文为准。专利权人认可证据3中文译文的准确性，合议组确认证据3的中文译文以请求人提交的译文为准。
（四）关于专利法第26条第4款有关权利要求应当得到说明书支持的规定
专利法第26条第4款规定：权利要求书应当以说明书为依据，清楚、简要地限定要求专利保护的范围。
权利要求书应当以说明书为依据，是指权利要求书应当得到说明书的支持。权利要求书中的每一项权利要求所要求保护的技术方案应当是所属技术领域的技术人员能够从说明书中公开的内容得到或者概括得出的技术方案，并且不得超出说明书公开的范围。如果权利要求的概括包含申请人推测的内容，而其效果又难于预先确定和评价，应当认为这种概括超出了说明书公开的范围，该权利要求得不到说明书的支持。反之，则该权利要求得到了说明书的支持。
（1）关于权利要求1、2
本专利权利要求1请求保护一种编码赖氨酸脱羧酶的基因，它具有序列表中SEQ ID NO：4给出的氨基酸序列。权利要求2进一步限定权利要求1中所述的基因具有序列表中SEQ ID NO：3的第1005至3143位密码的核苷酸序列。
本专利说明书第3页第6-9行记载本发明的赖氨酸脱羧酶基因具有序列表中SEQ ID NO：3所示DNA序列片段中全部核苷酸序列的第1005-3143位核苷酸，其编码的赖氨酸脱羧酶氨基酸序列在序列表SEQ ID NO: 4中给出。说明书实施例1、2进行了上述基因的克隆和测序，并验证了其编码的蛋白质的功能。因此，虽然说明书中没有与权利要求1中同样的文字记载，但本领域技术人员根据专业常识能够从说明书中公开的内容得到或者概括得出权利要求1所限定的技术方案实质上是指编码具有序列表中SEQ ID NO：4的氨基酸序列的赖氨酸脱羧酶的基因）以及权利要求2的技术方案，这种概括未超出说明书公开的范围，且不包含推测的内容。因此，请求人认为本专利权利要求1、2不符合专利法第26条第4款的理由不能成立。
（2）关于权利要求3
本专利权利要求3要求保护权利要求1的编码赖氨酸脱羧酶的基因，其中所涉及的氨基酸序列具有一个或多个氨基酸残基替换、缺失或插入，但基本上没有任何赖氨酸脱羧酶活性的退化。
根据本专利说明书的记载，本发明在大肠杆菌中获得了不同于已知的cadA赖氨酸脱羧酶的另一种赖氨酸脱羧酶基因ldc，并鉴定了其基因序列以及编码的氨基酸序列（SEQ ID NO：4），但是，本专利说明书中并没有给出SEQ ID NO：4中哪些属于非活性必需的氨基酸残基，也没有给出任何在SEQ ID NO：4所示的赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸残基替换、缺失或插入的序列并验证其功能“基本上没有任何赖氨酸脱羧酶活性的退化”。根据本专利说明书的记载，SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有713个氨基酸，因此权利要求3中限定的具有一个或多个氨基酸残基替换、缺失或插入的氨基酸序列实际上包括了数量巨大的氨基酸残基修饰的数目和具体位置均未具体限定的SEQ ID NO：4的衍生序列。根据审查指南第二部分第十章9.3.1.1（4）的规定，对于具有某一特定功能的基因，可采用术语“取代、缺失或添加”与功能相结合的方式进行限定。但是允许采用该方式表述的条件是说明书中列举了所述的在原始序列基础上经“取代、缺失或添加”的衍生序列，并记载了制备该序列以及证明其功能的技术手段，而本专利说明书并未例举任何衍生序列。本领域技术人员已知，作为蛋白质一级结构的氨基酸序列是其空间结构的基础，而蛋白质的空间结构又是其功能的基础，同源性较高的蛋白质是否具有相似的空间结构和相似的功能，主要取决于那些在维系其空间结构以及功能、活性中起关键作用的氨基酸残基的差异以及这些差异是否足以改变其空间构象和相应的生物学功能及活性。如果蛋白质氨基酸序列中的某些起关键作用的氨基酸改变，会导致蛋白质空间结构与生物学活性或功能的巨大变化。对于本发明所分离的ldc基因及其编码的蛋白也是如此，基因序列的改变往往会导致其编码的氨基酸序列发生变化，而一些关键部位（如结构域、酶活性部位等）氨基酸的改变会大大改变其生物学功能及活性。因此，虽然权利要求3中采用了功能性限定“基本上没有任何赖氨酸脱羧酶活性的退化”，但是对于核酸序列来说，其是否具有某种功能是需要可信的实验证据证实的，而本申请说明书中并没有给出任何证据充分、明确地证明由权利要求3中限定的众多核苷酸序列中哪些序列基本上没有任何赖氨酸脱羧酶活性的退化，因而权利要求3所概括的技术方案包含了推测的内容，因此权利要求3得不到说明书的支持,不符合专利法第26条第4款的规定。
综上所述，合议组对专利权人以非必需氨基酸残基的修饰不会影响酶活性为由而坚持权利要求3得到说明书支持的主张不给予支持。
（3）关于权利要求4－8
权利要求4请求保护一种具有L－赖氨酸生产能力的埃希氏杆菌属的微生物，并且其细胞内赖氨酸脱羧酶活性降低或消失，其中细胞内赖氨酸脱羧酶活性通过权利要求1-3任一项中限定的基因的表达受限或通过cadA基因和权利要求1-3任一项中限定的基因的表达受限而降低或消失。
根据本专利说明书的记载可知：实施例1建立了ldc基因功能受损的WC196L菌株、cadA缺陷的WC196C菌株以及ldc基因功能受损同时cadA缺陷的WC196LC菌株，实施例2鉴定了上述菌株的赖氨酸降解活性，发现与野生型WC196菌株相比，WC196L/ WC196C以及WC196LC菌株的赖氨酸累积量均有所增加，而L－赖氨酸降解产物1，5－戊二胺均减少或者未检测到，从而证明了WC196L/ WC196C以及WC196LC菌株中的赖氨酸脱羧酶活性降低或消失，实施例3进一步验证了菌株WC196LC的赖氨酸脱羧酶活性的缺失与其中ldc基因功能受损直接相关。综上所述，本专利实施例中仅记载了ldc基因功能受损的大肠杆菌WC196L菌株、cadA缺陷的WC196C菌株以及ldc基因功能受损同时cadA缺陷的WC196LC菌株并验证了其生产L赖氨酸的能力，而权利要求4中将所述微生物概括至埃希氏杆菌属。本领域技术人员已知，埃希氏杆菌属均包括多种不同的菌种，每一菌种又有多种不同的菌株。不同菌种、甚至相同菌种的不同菌株间均具有不同的特性，本专利实施例中使用的几种菌株是具有把“细胞内赖氨酸脱羧酶活性通过权利要求1-3任一项中限定的基因的表达受限或通过cadA基因和权利要求1-3任一项中限定的基因的表达受限而降低或消失”特性且可生产L－赖氨酸的菌株，虽然利用转基因方式可以对会埃希氏杆菌属菌株进行转化，但并非只要属于埃希氏杆菌属的任何菌株在采用本专利的方法进行转化后均可以实现本发明预期的技术效果。在本专利说明书实施例中仅使用了特定的具体菌株进行了试验并验证其试验效果的情况下，本领域技术人员根据本专利说明书的描述尚不能预见所有属于埃希氏杆菌属的微生物都可以通过权利要求1-3任一项中限定的基因的表达受限或通过cadA基因和权利要求1-3任一项中限定的基因的表达受限而使赖氨酸脱羧酶活性降低或消失，从而提高其生产L－氨基酸的产量。因此，权利要求4的概括包含了专利权人推测的内容，而其效果又难于预先确定和评价，应当认为这种概括超出了说明书公开的范围。
权利要求5―7直接或间接引用了权利要求4，而且未对权利要求4所述的“埃希氏杆菌”作进一步限定，权利要求8要求保护一种生产L－赖氨酸的方法，其中限定的微生物也为埃希氏杆菌，且其功能限定与权利要求4类似。基于上述相同的理由，权利要求5-8也得不到说明书的支持，不符合专利法第26条第4款的规定。
专利权人认为：本发明保藏了所用大肠杆菌菌株，且说明书第5、6页记载了限制赖氨酸脱羧酶基因的表达方法，说明书实施例1（4）和附图2给出了赖氨酸脱羧酶基因中核苷酸残基修饰的具体实施例，且埃希氏杆菌属微生物用于L－赖氨酸生产是现有技术中已知的。本发明的技术在于使微生物细胞中赖氨酸脱羧酶活性降低而消失，本领域技术人员可以预测，对于具有赖氨酸生产能力并有ldc基因编码的赖氨酸脱羧酶活性的埃希氏杆菌微生物均能用于实现本发明的技术方案。
对此，本案合议组认为：尽管本专利说明书例举了现有技术中已知的赖氨酸脱羧酶基因cadA受损的大肠杆菌，例如来源于大肠杆菌K－12的GNB10181菌株（参见说明书第10页第2段），但是，首先，这些菌株均是采用现有技术中已知的技术手段对已知的赖氨酸脱羧酶cadA进行修饰进行氨基酸生产的载体，没有证据表明这些菌株均可以适用本发明的方法且可以达到提高其自身氨基酸产量的目的；其次，即便所述菌株可以适用于本发明的方法，但本领域技术人员也无法由此概括至所有的埃希氏菌属的范围。对于产品权利要求，通常应当尽量避免使用功能或效果特征来限定发明，只有在某一技术特征无法用结构特征来限定，或者用结构特征限定不如用功能或效果特征限定更为恰当，而且该功能或效果能通过说明书中规定的实验或者操作或者所属技术领域的惯用技术手段直接和肯定地验证的情况下，使用功能或者效果特征来限定发明才可能是允许的。本专利说明书仅仅采用几个具体菌株进行了实验，本领域技术人员无法确定属于“埃希氏杆菌”的任意菌株均可用于实现上述功能和特性。可见，专利权人的意见也无法证明本专利权利要求4-8符合专利法第26条第4款的规定。
（五）关于本案中的其他无效理由
综上所述，鉴于本专利权利要求3―8均不符合专利法第26条第4款的规定，应被无效，故对于请求人在本无效宣告请求案中针对权利要求3―8提出的其它无效宣告请求理由，本案合议组不再予以评述，下面仅针对涉及权利要求1、2的其他无效宣告请求理由进行评述。
（1）关于专利法第26条第4款有关权利要求应当清楚的规定
专利法第26条第4款规定：权利要求书应当以说明书为依据，清楚、简要地限定要求专利保护的范围。
根据该款规定，每项权利要求的类型和所确定的保护范围应当清楚。权利要求的保护范围应当根据其所用词语的含义来理解。
针对本专利权利要求1和2请求保护的范围是否清楚的问题，
请求人认为，本领域技术人员已知基因是核酸序列，不可能具有氨基酸序列，因此权利要求1以及引用权利要求1的权利要求2保护范围不清楚，且不能以说明书内容对其进行随意解释。专利权人认为，根据本领域技术人员的常识，基因是一种核酸序列，权利要求1中“具有序列表中SEQ ID NO：4给出的氨基酸序列”是指所述基因编码SEQ ID NO:4给出的氨基酸序列，即赖氨酸脱羧酶序列，这是本领域技术人员根据说明书记载所能得出的唯一合理解释。
对此，合议组认为：根据专利法第56条的规定，发明专利权的保护范围以其权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求。因此，判断权利要求的保护范围是否清楚，应当以所属领域技术人员作为判断的主体，根据本领域的公知常识以及申请文件的整体内容，从技术含义的角度进行分析判断，而不能抛开说明书记载的内容和本领域技术人员掌握的公知常识，本领域技术人员公知基因本身是核酸序列，不是氨基酸序列。所以，权利要求1中的“它”理解为指代“基因”是明显不合常理的，而本专利说明书第14-19页给出了ldc基因序列及其编码的赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列，其中SEQ ID NO: 4为赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列，此外，说明书第3页第6-9行明确记载本发明的赖氨酸脱羧酶基因编码的赖氨酸脱羧酶氨基酸序列在序列表SEQ ID NO: 4中给出，SEQ ID NO:3为赖氨酸脱羧酶基因的DNA序列，权利要求2进一步限定了权利要求1中所述的基因具有序列表中SEQ ID NO：3的第1005至3143位密码的核苷酸序列。因此本领域技术人员根据本专利文本记载的整体内容，可以合理地理解权利要求1中的“它”是指赖氨酸脱羧酶，权利要求1要求保护的是编码SEQ ID NO: 4的赖氨酸脱羧酶氨基酸序列的基因。所以本专利权利要求1、2请求保护的范围是清楚的，请求人认为权利要求1、2不清楚的理由不能成立。
（2）关于专利法第26条第3款
专利法第26条第3款规定：说明书应当对发明或者实用新型作出清楚、完整的说明，以所属技术领域的技术人员能够实现为准。
所属技术领域技术人员能够实现，是指所属技术领域技术人员按照说明书记载的内容，就能够实现该发明的技术方案，解决其技术问题，并产生预期的技术效果。
本专利权利要求1、2涉及一种新的编码赖氨酸脱羧酶的基因。说明书公开了其要求保护的ldc基因的序列及其编码的氨基酸序列（参见说明书第3页第2段，序列表SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4）。实施例1公开了克隆所述ldc基因以及确定其核苷酸序列的过程，获得了含有ldc基因的大肠杆菌AJ13068，并于1994年12月6日将其保藏于日本国立生命科学和人体技术研究所，于1995年9月29日按照布达佩斯协议转入国际保藏中心。然后采用对大肠杆菌W3110进行人工化学诱变的方法制备了具有L－赖氨酸生产能力的大肠杆菌株W196（命名为AJ13069），其国内保藏以及按照布达佩斯协议的国际保藏时间均与AJ13068相同。实施例1还利用W196菌株建立了ldc基因功能受损的WC196L菌株、cadA缺陷的WC196C菌株以及ldc基因功能受损且cadA缺陷的WC196LC菌株。实施例2证明与野生型WC196菌株相比，WC196L/ WC196C以及WC196LC菌株的赖氨酸累积量均有所增加，而L－赖氨酸降解产物1，5－戊二胺均减少或者未检测到，从而证明了WC196L/ WC196C以及WC196LC菌株中的赖氨酸脱羧酶活性降低或消失。实施例3进一步验证了菌株WC196LC的赖氨酸脱羧酶活性的缺失与其中ldc基因功能受损直接相关。综上所述，本专利说明书公开了权利要求1、2要求保护的ldc基因的核苷酸及其编码的氨基酸的序列，记载了其制备方法并验证了ldc缺陷对提高L－赖氨酸产量的效果。
请求人认为，专利权人于1995年9月29日将本专利涉及的菌株AJ13068和AJ13069送交国际保藏机构保藏，晚于本专利的优先权日，不符合第二次修订的专利法实施细则第25条（即第三次修订的专利法实施细则第24条）的要求，从而造成本专利说明书公开不充分，不符合专利法第26条第3款的规定。
对此，合议组认为，首先，由说明书实施例1第（1）部分公开的内容可知，AJ13068是含有质粒PUC GF5HH5的大肠杆菌JM109，其中JM109是现有技术已知的大肠杆菌菌株，质粒PUC GF5HH5是含有ldc基因序列的质粒PUC19，实施例1中介绍了其制备过程。专利权人将该菌株保藏的目的在于使本领域技术人员可以由该菌株方便的获得ldc基因。然而，即便该菌株未提交保藏，本领域技术人员也可以根据实施例1中记载的实验流程获得ldc的基因序列，这一过程既不包括不可重复实施的步骤，也不涉及无法获得的实验材料。此外，本领域技术人员还可以根据本专利说明书公开的ldc的基因序列通过一般的分子生物学手段（如PCR）等获得ldc基因。因此，本领域技术人员要获得ldc基因并非只能通过提交保藏的菌株AJ13068，换言之，说明书公开的内容足以使本领域技术人员获得ldc基因，因此菌株AJ13068并非必须提交保藏。其次， AJ13069菌株是由大肠杆菌W3110通过人工化学诱变制备的具有L－赖氨酸生产能力的大肠杆菌菌株，其中涉及本领域技术人员无法重复实施的化学诱变过程，公众根据本专利说明书的记载无法获得AJ13069菌株，根据案卷材料可知，专利权人于申请日时提交了AJ13069菌株的保藏证明和存活证明，其提交国家知识产权局认可的国际保藏单位的保藏时间为1995年9月29日，在本专利的优先权日1994年12月9日之后，申请日1995年12月5日之前，本专利说明书第9页第11-14行亦有相关记载。因此本技术领域技术人员按照说明书记载的内容，能够实现本发明的技术方案，解决其技术问题，并产生预期的技术效果，即本专利说明书已充分公开。请求人认为本专利说明书不符合专利法第26条第3款的规定的理由不能成立。第三，第二次修订的专利法实施细则第25条规定，要求优先权的申请应在优先权日之前对该申请涉及的公众不能获得的生物材料进行保藏，其目的在于保障该申请切实能够享有优先权。而享有优先权的意义在于，申请人有权要求在对其申请或专利进行审查时，以优先权日作为判断新颖性和创造性的时间标准。在本无效宣告请求案中，请求人主张权利要求1－８不具有创造性的无效理由可能需要判断本专利是否享有优先权，但是请求人提出的用于证明本专利不具备创造性的证据1和2的公开日期均在本专利优先权日之前。因此，是否享有优先权并不影响本案的审理。
（3）关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指同申请日以前已有的技术相比，该发明有突出的实质性特点和显著的进步。
如果已有技术中没有给出将权利要求与最接近的已有技术间的区别技术特征应用到该最接近已有技术以解决权利要求的限定的发明实际解决的技术问题的启示，并且要求保护的技术方案能够产生有益的技术效果，则认为该权利要求所限定的发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
本专利权利要求1请求保护一种编码赖氨酸脱羧酶的基因，它具有序列表中SEQ ID NO：4给出的氨基酸序列。根据说明书的记载，其是一种不同于已知赖氨酸脱羧酶基因cadA的新基因，说明书中将其命名为ldc（参见说明书第2页第2段）。
证据1中公开了在非诱导条件下的大肠杆菌中存在低水平的赖氨酸脱羧酶的活性，并发现诱导和非诱导条件下，赖氨酸脱羧酶对腐胺的敏感性存在差异，这种差异提供了这样一个证据，即存在于未诱导细胞中的酶活性不同于存在于诱导细胞中的酶活性（诱导型的第一种赖氨酸脱羧酶的存在是已知的），也就是说它是所述的假定的（新的）赖氨酸脱羧酶，并将其命名为LDC（参见证据1译文第1页第1、4、5段）。
证据2公开了大肠杆菌赖氨酸脱羧酶的cadA基因的核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列（参见请求人提交的证据2的中文译文），同时还指出，在大肠杆菌中已经观察到第二赖氨酸脱羧酶的存在，但是对第二赖氨酸脱羧酶基因的基因座尚未作图，也未报导纯化的蛋白质，其使用cadA探针通过Southern杂交探查大肠杆菌的染色体DNA的初步实验未能在所用条件下鉴定到与cadA同源的第二区域（参见专利权人提供的证据2的中文译文）。
请求人将证据1作为最接近的对比文件，认为证据1公开了在一种大肠杆菌突变株中检测到赖氨酸脱羧酶活性，该酶是由ldc基因编码的，本领域技术人员如果要获得证据1中的ldc序列，很容易想到用证据2公开的cadA基因或其部分作为探针，在大肠杆菌的cDNA文库中进行常规的筛选，即可获得权利要求1要求保护的技术方案。
对此，合议组认为，将本专利权利要求1的技术方案与证据1公开的内容进行对比，其区别技术特征在于，证据1的实验结果表明，存在与已知的诱导型赖氨酸脱羧酶不同的第二种赖氨酸脱羧酶LDC，但其并没有得到纯化的酶蛋白并鉴定出其编码基因或氨基酸序列。而权利要求1的技术方案包括了ldc基因的序列及其编码的氨基酸序列，说明书中还公开了其技术效果，即所述ldc缺陷的菌株的L－赖氨酸生产率得到提高（参见实施例2，表1）。据此区别技术特征，其实际解决的技术问题在于提供一种修饰后对提高L－赖氨酸产率有积极效果的新的赖氨酸脱羧酶基因和其氨基酸序列。证据2公开了已知的cadA基因序列及其编码的氨基酸序列，并提到使用cadA探针通过Southern杂交探查大肠杆菌的染色体DNA的初步实验未能在所用条件下鉴定到与cadA同源的第二种赖氨酸脱羧酶。本领域技术人员已知，Southern杂交的基本原理在于将待测DNA样品固定在固相载体上，与标记的核苷酸探针进行杂交，在于探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。因此，按照Southern杂交的方法成功分离新基因的前提是用来设计探针的已知基因的序列与待测基因序列具有足够高的同源性。尽管证据1中所述的第二种酶与已知的赖氨酸脱羧酶酶具有类似的功能，但其酶活性差别巨大（分别为4.6 nmoles/min/mg和1123 nmoles/min/mg），同时在对腐胺和亚精胺的敏感性等方面也有很大区别（参见证据1中文译文第1页第1段，表1），根据这些信息，本领域技术人员很难判断所述新酶与已知酶基因序列的同源性究竟有多少，两种酶的基因序列可能差别很大，甚至完全不同。而由于证据2利用cadA探针采用Southern 杂交鉴定所述新基因的初步实验并没有成功，本领域技术人员也无法从中得到技术启示，利用已知的cadA基因分离新的赖氨酸脱羧酶。因此，证据1、2中均没有公开利用已知的cadA基因获得本专利权利要求1的技术方案的技术启示。可见，已有技术中没有给出将上述区别技术特征应用到最接近已有技术以解决发明实际解决的技术问题的启示，并且权利要求1要求保护的技术方案能够产生有益的技术效果，权利要求1相对于证据1和2的结合具有突出的实质性特点和显著的进步，具备创造性，在此基础上，引用权利要求1的权利要求2也具备创造性。
基于以上事实和理由，本案合议组作出如下审查决定。
三、决定
宣告第95197577.3号发明专利权利要求3-8无效，在专利权人于2009年1月24日提交的权利要求1、2的基础上维持专利权有效。
当事人对本决定不服的，可以根据专利法第46条第2款的规定，自收到本决定之日起三个月内向北京市第一中级人民法院起诉。根据该款的规定，一方当事人起诉后，另一方当事人应当作为第三人参加诉讼。
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