发明创造名称：利用海洋微藻异养培养生产长链多不饱和脂肪酸
外观设计名称：
决定号：15979
决定日：2011-01-17
委内编号：4W01889
优先权日：
申请（专利）号：00135338.1
申请日：2000-12-11
复审请求人：
无效请求人：马泰克生物技术公司
授权公告日：2005-09-07
审定公告日：
专利权人：姜悦;陈璇;李建胜
主审员：
合议组组长：郭婷
参审员：吴文英
国际分类号：C12N 1/12; C12P 7/64
外观设计分类号：
法律依据：专利法第26条第4款；专利法实施细则第20条第1款；专利法第22条第2款
决定要点：权利要求书应当以说明书为依据，是指权利要求应当得到说明书的支持，权利要求书中的每一项权利要求所要求保护的技术方案应当是所属技术领域的技术人员能够从说明书充分公开的内容中得到或概括得出的技术方案，并且不得超出说明书公开的范围。权利要求应当清楚表述请求保护的范围，所谓清楚是指对权利要求所请求保护的技术方案的描述是清楚的，所属领域的普通技术人员可以准确理解该技术方案。如果要求保护的发明与对比文件相比，其区别仅在于前者采用上位概念，而后者采用下位概念限定同类性质的技术特征，则下位概念的公开使上位概念限定的发明丧失
全文：
一、案由
本专利的专利号为00135338.1，申请日为2000年12月11日，授权公告日为2005年09月07日。本专利授权公告时的权利要求书如下：
“1、一种培养基，包括碳源、氮源、无机盐，其中所述的碳源选自废糖蜜、玉米粉、蔗糖、果糖、乳糖、葡萄糖、可溶性淀粉二氧化碳或其混合物；所述氮源选自有机氮化合物、无机氮化合物或其混合物，所述无机氮化合物包括硝酸铵、硫酸铵、尿素或其混合物；所述有机氮化合物包括脯氨酸、精氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、蛋白胨、谷氨酸或其混合物；所述无机盐至少选自下列一种物质：钠盐、钾盐、镁盐、碳酸盐铁盐、锰盐、钴盐、钼酸盐、锌盐、硼化物、溴化物及其混合物；其中所述的碳源浓度为10-200g/L；所用的氮源浓度是培养基中碳源浓度的1/2-1/10；所述的无机盐浓度，以钠盐为标准，为0.01-12ppm，培养基的pH值为3.0-12.0。
2、权利要求1的培养基，其中所述的碳源浓度为20-100g/L。
3、一种长链多不饱和脂肪酸，包括二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸的生产方法，其包括下列步骤：
（1）对Thraustochytriaceae藻类进行l0°C培养，再于10-50°C摇瓶振荡培养，选择有活性的藻种，再反复进行所述步骤，选择性能稳定的藻种；
（2）将所得到的Thraustochytriaceae藻类在权利要求1的培养基中进行预培养；
（3）经预培养后，进行藻细胞的快速生长和多不饱和脂肪酸的累积；
（4）收集细胞和酯化从而得到所需要的长链多不饱和脂肪酸。
4、权利要求3的方法，其中预培养的温度为10-20℃。
5、权利要求3的方法，上述的Thraustochytriaceae经预培养后的培养温度为20-45℃。
6、权利要求3的方法，其中所述的培养是在通气和搅拌条件下进行的。
7、权利要求3的方法，其中所述的培养可以在有光或无光条件下进行。
8、一种Thraustochytriaceae微藻培养方法，包括下列步骤：
（1）对Thraustochytriaceae微藻进行l0°C培养，再于10-50°C摇瓶振荡培养，选择有活性的藻种，再反复进行所述步骤，选择性能稳定的藻种；
（2）将所得到的Thraustochytriaceae藻类在权利要求1或2的培养基中进行预培养；
（3）经预培养后，再接种到上述的权利要求1或2的培养基中。
9、权利要求8的方法，其中预培养中脯氨酸与硫酸铵的比例大于2：1。
10、权利要求9的方法，其中预培养中脯氨酸与硫酸铵的比例大于5：1。
11、权利要求10的方法，其中预培养中脯氨酸与硫酸铵的比例大于10：1。
12、权利要求11的方法，其中预培养中脯氨酸完全代替硫酸铵。
13、权利要求8的方法，其中预培养的温度为10-20℃。
14、权利要求8的方法，上述的Thraustochytriaceae经预培养后的培养温度为20-45℃。
15、Thraustochytriaceae在生产二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸中的应用。”
请求人于2007年08月22日向专利复审委员会提出了无效宣告请求，其理由是权利要求1－14不符合专利法第26条第4款和实施细则第20条第1款的规定，说明书不符合专利法第26条第3款的规定，权利要求15不符合专利法第22条第2款的规定。请求宣告本专利权利要求1－15全部无效，同时提交了如下证据1-6：
证据1：P．K．Balpal等，JAOCS，1991年7月，第68卷第7期，第509-514页（证据1-1）；相关公证认证文件5页及公证书译文4页（证据1-2）；该文献的部分译文共3页（证据1-3），复印件共18页。
证据2：Iwao IIDA等，Journal of Fermentation and Bioengineering，第81卷第1期，第76-78页，1996年（证据2-1）；相关公证认证文件5页及其译文4页（证据2-2）；该文献相关部分译文2页（证据2-3），复印件共13页。
证据3：A.Ashford等，Lipids，第35卷第12期，第1377-1385页，2000年（证据3-1）；相关公证认证文件5页及公证书译文4页（证据3-2）；该文献相关部分译文3页（证据3-3），复印件共21页。
证据4：T．Nakahara等，JAOCS，第73卷第11期，第1421-1426页，1996年（证据4-1）；相关公证认证文件4页及公证书译文4页（证据4－2），该文献相关部分译文1页（证据4-3），复印件共15页。
证据5：美国专利US5,130,242共31页（证据5-1），公开日1992年7月14日，及相关部分译文4页（证据5-2），复印件共35页。
证据6：欧洲专利申请EP0823475A1共32页（证据6-1）及相关部分译文2页（证据6-2），公开日1998年2月11日，复印件共34页。
请求人认为:
1)权利要求1与说明书实施例中所述无机盐的浓度单位不同。在所有的实施例中所采用的培养基中无机盐的浓度都在5000ppm以上，而权利要求1中所要求保护的培养基的无机盐浓度仅有0.01-12ppm。对于本领域技术人员来说，没有办法或不能从说明书公开的培养基中得到权利要求1所要求保护的技术方案，权利要求1的保护范围超出了说明书记载的内容。因此，权利要求1得不到说明书的支持，从属于权利要求1的权利要求2也得不到说明书的支持；独立权利要求3和8的方法中使用了权利要求1的培养基，根据同样的理由，权利要求3和8也得不到说明书的支持，从属于权利要求3的权利要求4－7和从属于权利要求8的权利要求9－14也得不到说明书的支持。因此，权利要求1－14不符合专利法第26条第4款的规定。
2）本发明具体实施方式中所有的实施例所采用的培养基的无机盐的浓度都大于5g/L(约5000ppm)，而不是发明内容及权利要求书中所记载的0.01-12ppm。在本专利说明书的其它部分，也没有看到任何有关制备具有所述无机盐浓度的培养基的方法及相关实验数据。对于本领域的技术人员来说，根据该专利说明书公开的内容，没有办法或不能实现发明内容及权利要求书中所记载的培养基这一技术方案。说明书所记载的与权利要求1-14有关的技术方案都用到了不能实现的培养基这一技术方案，因此，所述的这些技术方案，对于本领域的技术人员来说，根据说明书的记载，也是不能实现的，说明书不符合专利法第26条第3款的规定。
3）权利要求1保护范围不清楚，本领域技术人员不清楚“以钠盐为标准”，是以哪一种钠盐为标准， 也不清楚怎么样以“钠盐为标准”来得知其配方中无机盐的具体浓度，因此权利要求1不符合专利法实施细则第20条第1款的规定，根据同样的理由，其从属权利要求2和使用了权利要求1或2培养基的权利要求3－14也不符合专利法实施细则第20条第1款的规定。
4）证据1公开了采用Thraustochytrium?aureum?ATCC?34304优化生产二十二碳六烯酸(DHA)，表3表明Thraustochytriumaureum?ATCC?34304可以用来生产DHA(二十二碳六烯酸)和DPA(二十二碳五烯酸)(请见512页，表3)；证据2公开了通过优化培养基培养Thraustochytrium?aureum来提高二十二碳六烯酸的产量，图1显示DHA的含量为大约40％，除了DHA以外的多不饱和脂肪酸为二十二碳五烯酸(DPA)、二十碳五烯酸(EPA)和花生四烯酸(ARA)，其研究结果表明：Thraustochytrium?aureum?ATCC?34304可以用来同时生产二十二碳六烯酸(DHA)和二十二碳五烯酸(DPA)；证据3公开了通过电子显微镜法研究在Schizochytrium?Sp.中富含二十二碳六烯酸(DHA)油脂的结构，表1显示Schizochytrium?Sp.的总的脂肪酸的组成相当简单，它主要由五种主要的脂肪酸组成：DHA(占总脂肪酸的32.9％)、DPA(约占总脂肪酸的11％)、十四酸(占总脂肪酸的14.3％)、棕榈酸(占总脂肪酸的25.1％)和十六碳烯酸，其表明Schizochytrium?Sp.可用来生产DHA和DPA；证据4公开了将密克罗西亚岛珊瑚礁区域的海洋微生物(SR21菌株)通过筛选进行分离以进行生产多不饱和脂肪酸的实验，揭示了SR21菌株是极好的DHA和n-6?DPA的微生物来源；证据5公开了一种异养培养生产Omega-3高度不饱和脂肪酸含量高的微生物产品的方法，表3显示Schizochytrium?sp.ATCC20889，Schizochytrium?sp.ATCC20888，Schizochytrium?aggregatum?ATCC28209和Thraustochytrium?rosrum?ATCC?28211生产的脂肪酸中包含二十二碳六烯酸C22：6w3(DHA)和二十二碳五烯酸C22：5w3和C22：5w6(DPA)，其采用的菌株同本专利采用的菌株相同；证据6公开了Schizochytrium属SR21菌株能够用来生产(n-3)系列的二十二碳六烯酸DHA和(n-6)系列的二十二碳五烯酸DPA，表5显示Schizochytrium属SR21菌株可以有效地用来生产具有相当高含量DHA的油脂，所获得的油脂同时还含有二十二碳五烯酸DPA，其中的Schizochytrium属SR21菌株和本专利中所采用的菌株相同；因此，本专利权利要求15保护的发明在本专利的申请日之前已经被证据1、2、3、4、5或6公开，权利要求15不具备专利法22条第2款规定的新颖性。
经形式审查合格，专利复审委员会于2007年10月12日受理了上述无效宣告请求并将无效宣告请求书及证据副本转给了专利权人，同时成立合议组对本案进行审查。
专利权人针对上述无效宣告请求于2007年11月26日提交了意见陈述书，并提交以下反证：
反证1：本专利说明书第2页第12－17行的参考译文1页。
反证2：请求人方提交的证据2的第2栏倒数第3行－第3栏第1段的参考译文1页。
专利权人提出：1）请求对申请文件进行修改，在原权利要求书中的权利要求15中增加一个新的技术特征，形成新的权利要求如下：“15、Thraustochytriaceae在生产二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸中的应用，其中所述的Thraustochytriaceae是用权利要求1或2所述培养基培养的，或者是根据权利要求8的方法培养的”，但未提交权利要求书的替换页。
(2)权利要求1－14的支持问题： 权利要求中所述无机盐浓度是一个明显的笔误，其中ppm应该是g/L。本领域普通技术人员通过阅读整篇说明书，特别是实施例的内容，可以清楚地明白这是笔误。理由如下：1)本专利说明书第3页第21-22行记载“对于无机盐类，使用天然海水是最好的，但也可以用各种钠盐、钾盐、镁盐、碳酸盐等配制”，天然海水的无机盐浓度若以g/L为单位，天然海水的盐度为约35‰，即35g/L；2)本专利的所有实施例中所采用的培养基中无机盐的浓度都是以g/L为单位的，在0.01-12g/L的范围内；3)请求人提交的证据2[注：证据2是本专利背景技术中引用的文献(此处译文参见反证1)]，研究了盐浓度对菌种生长的影响，结论是盐度为海水的一半(约17g/L)最好[参见证据2第3栏第3行(此处译文参见反证2)]。因此，本领域普通技术人员在阅读了说明书的全部内容之后结合本领域的知识很容易看出权利要求1中记载的单位“ppm”应是“g/L”。其次，根据本专利说明书公开的全部内容，尤其是实施例，所属技术领域的技术人员结合本领域的知识可以合理预测到权利要求1的技术方案能够解决本发明所要解决的技术问题。因此，本权利要求1－14满足专利法第26条第4款的规定，应该给予维持。
（3）说明书充分公开问题。基于上述意见陈述，权利要求的ppm是一个明显的笔误，应该是g/L。因此，本专利的说明书已经充分公开，完全满足专利法第26条第3款的规定。
（4）清楚问题。“以钠盐为标准”的钠盐指的是“氯化钠”，因为海水中的盐分主要是以氯化钠为主。以钠盐为标准计量海水或咸水的盐度是本领域的常规方法。对于本领域普通技术人员来说，通过阅读权利要求1的技术方案后，完全能够确定配方中无机盐的具体浓度，因此，本专利权利要求1-14完全满足专利法实施细则第20条第1款的规定，应该给予维持。
（5）经过修改后的新的权利要求15相对于对比文件1-6具有新颖性，完全符合专利法第22条第2款的规定。请求人提交的证据1-6与本专利权利要求书中所述的技术方案存在着明显的不同。
专利复审委员会本案合议组于2010年10月12日向请求人发出了转送文件通知书，将专利权人于2007年11月26日提交的意见陈述书及其所附反证转送给请求人。
专利复审委员会本案合议组于2010年11月29日向双方当事人发出了口头审理通知书，定于2010年12月14日举行口头审理。
口头审理如期举行，双方当事人均委托代理人参加了本次口头审理。在口头审理过程中，双方当事人对合议组成员无回避请求，对对方出庭人员的身份和资格没有异议。在口头审理过程中确认的事实如下：（1）专利权人放弃了对权利要求书的修改，本案依据授权公告文本进行审查；（2）请求人确认无效范围及理由与请求书中的一致；（3）专利权人对请求人提供的证据1－6的真实性、合法性、关联性以及相关部分的译文准确性无异议，请求人对专利权人提供的反证1－2的真实性、合法性、关联性和译文准确性无异议；请求人当庭放弃了证据3的使用；（4）专利权人认为权利要求15虽然未引用权利要求1－2的培养基或权利要求3－14的方法，但作为完整的权利要求书整体而言，权利要求15应当理解为隐含引用了在前的权利要求，否则缺乏单一性。认为若以字面意思理解权利要求15的范围，则证据6能够破坏权利要求15的新颖性。
至此，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
（一）、审查基础
专利权人未提交权利要求书修改替换页，因此本决定所依据的文本是本专利的授权公告文本。
（二）、关于无效理由和证据
根据请求人意见陈述书的意见和口头审理中的确认，本案审查的无效理由为：权利要求1－14不符合专利法第26条第4款的规定；权利要求1－14不符合专利法实施细则第20条第1款的规定；权利要求15不符合专利法第22条第2款的规定；权利要求1－14的技术方案在说明书中未充分公开，说明书不符合专利法第26条第3款的规定。
由于请求人放弃了证据3，专利权人对证据1－2、4－6无异议，因此，合议组对证据1－2、4－6予以采纳。请求人对反证1－2无异议，因此，合议组对反证1－2予以采纳。
（三）关于专利法实施细则第20条第1款
权利要求应当清楚表述请求保护的范围，所谓清楚是指对权利要求所请求保护的技术方案的描述是清楚的，所属领域的普通技术人员可以准确理解该技术方案。
本案中，权利要求1请求保护一种培养基，包括碳源、氮源、无机盐，所述无机盐至少选自下列一种物质：钠盐、钾盐、镁盐、碳酸盐铁盐、锰盐、钴盐、钼酸盐、锌盐、硼化物、溴化物及其混合物；所述无机盐的浓度，以钠盐为标准，为0.01-12ppm。根据本申请说明书第3页第21－24行的记载可知，对于无机盐类，可使用天然海水，也可以用各种钠盐、钾盐、镁盐、碳酸盐等配制。合议组认为：本领域技术人员不清楚权利要求中“以钠盐为标准”的定义，不确定该标准是针对钠盐在培养基中的摩尔数还是针对钠盐的质量数，不清楚0.01－12ppm的范围是单指钠盐本身，还是指所有无机盐的总浓度，也不清楚如何以钠盐为标准计算并控制无机盐的浓度。进一步而言，当采用天然海水时，本领域技术人员不清楚如何以钠盐为标准来计算盐度；当采用各种不同种类的盐配制时，本领域技术人员也不清楚如何以钠盐为标准控制其它无机盐的含量。本专利说明书中也没有对上述内容进行清楚的定义。说明书实施例的培养基中虽然具体使用了包括氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、氯化锰、氯化锌和硼酸在内的浓度从0.005 g/L-5 g/L不等的化合物作为无机盐来源，但是也没有说明钠盐标准是什么以及如何以钠盐为标准将这些化合物的浓度换算成培养基中总无机盐的浓度，本领域技术人员不能知晓通过什么换算方式能够将实施例所述具体无机盐浓度计算成权利要求1培养基中“所述无机盐的浓度，以钠盐为标准，为0.01-12ppm”。因此，本领域技术人员不清楚如何“以钠盐为标准”计算无机盐的浓度，权利要求1的保护范围不清楚，不符合专利法实施细则第20条第1款的规定。其从属权利要求2和引用了权利要求1的权利要求3－14也仍然存在同样的缺陷，不符合专利法实施细则第20条第1款的规定。
专利权人认为以钠盐为标准的钠盐指的是“氯化钠”，以钠盐为标准计算海水或咸水的盐度是本领域常规方法。
对此，合议组认为：专利权人没有提供证据说明以钠盐或氯化钠为标准计算海水或咸水的盐度是本领域常规方法。如上所述，本领域技术人员不清楚如何以钠盐为标准选取权利要求1所述的无机盐来源化合物制备出0.01-12ppm无机盐浓度范围的培养基。专利权人的意见陈述不具有说服力，合议组对专利权人的意见不予支持。
（四）关于专利法第22条第2款
专利法第22条第2款规定，新颖性，是指在申请日以前没有同样的发明或者实用新型在国内外出版物上公开发表过、在国内公开使用过或者以其他方式为公众所知，也没有同样的发明或者实用新型由他人向国务院专利行政部门提出过申请并且记载在申请日以后公布的专利申请文件中。
根据该款规定，如果要求保护的发明与对比文件相比，其区别仅在于前者采用上位概念，而后者采用下位概念限定同类性质的技术特征，则下位概念的公开使上位概念限定的发明丧失新颖性。
本案中，权利要求15请求保护Thraustochytriaceae在生产二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸中的应用。该权利要求为独立权利要求，未引用权利要求1－2的培养基或权利要求3－14的方法。权利要求中的Thraustochytriaceae为破囊壶菌科，其属于生物分类学中的“科”一类，包括了位于其分类学下层的多个种属的大量藻类。证据6（EP0823475A1，公开日1998年2月11日）公开了利用微藻生产不饱和脂肪酸的方法，其记载了采用Schizochytrium属SR21菌株制备二十二碳六烯酸DHA和二十二碳五烯酸DPA的方法(参见实施例3)，从实施例3内表5中能够清楚地看出该SR21菌株可以有效地用来生产具有相当高含量DHA同时还含有DPA的油脂。证据6的Schizochytrium属SR21菌株即属于权利要求15的Thraustochytriaceae (可参见本专利的表5)。因此，本专利权利要求15的技术方案已被证据6公开，权利要求15不符合专利法22条第2款有关新颖性的规定。
（五）其它
鉴于如上已得出权利要求1－15应予无效的结论，对于其它无效理由不再予以评述。
三、决定
宣告ZL00135338.1号发明的权利要求1－15全部无效。
当事人对本决定不服的，可以根据专利法第46条第2款的规定，自收到本决定之日起三个月内向北京市第一中级人民法院起诉。根据该款的规定，一方当事人起诉后，另一方当事人作为第三人参加诉讼。
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