发明创造名称：发酵生产L-氨基酸的方法
外观设计名称：
决定号：16706
决定日：2011-05-06
委内编号：4W02239，4W02542
优先权日：
申请（专利）号：97122854.X
申请日：1997-10-15
复审请求人：
无效请求人：长春大合生物技术开发有限公司
授权公告日：2003-06-04
审定公告日：
专利权人：味之素株式会社
主审员：
合议组组长：李金光
参审员：吴通义
国际分类号：C12N 15/54，C12N 15/70，C12N 1/21，C12P 13/08
外观设计分类号：
法律依据：专利法第26条第4款
决定要点：权利要求书应当以说明书为依据，是指权利要求书应当得到说明书的支持。权利要求书中的每一项权利要求所要求保护的技术方案应当是所属技术领域的技术人员能够从说明书中公开的内容得到或者概括得出的技术方案，并且不得超出说明书公开的范围。如果权利要求的概括包含申请人推测的内容，而其效果又难于预先确定和评价，应当认为这种概括超出了说明书公开的范围。
全文：
一、案由
本专利权涉及国家知识产权局于2003年6月4日公告授予的、名称为“发酵生产L－氨基酸的方法”的第97122854.X号发明专利权（下称本专利），其申请日为1997年10月15日，优先权日为1996年10月15日，专利权人为味之素株式会社。本专利授权公告的权利要求书如下:
“1、一种编码埃希氏杆菌属细菌天冬氨酸激酶Ⅲ的DNA，该DNA含有编码区的突变以消除所述天冬氨酸激酶的赖氨酸反馈抑制，
所述突变是：
天冬氨酸激酶Ⅲ的318位甲硫氨酸残基由另一个氨基酸取代且第323位甘氨酸残基由另一个氨基酸取代的突变，
所述酶的第325位亮氨酸残基由另一个氨基酸取代且第347位缬氨酸残基由另一个氨基酸取代的突变，
所述酶的第323位甘氨酸残基由另一个氨基酸取代且第347位缬氨酸残基被另一个氨基酸残基取代的突变，
所述酶的第325位亮氨酸残基由另一个氨基酸残基取代且第345位丝氨酸残基被另一个氨基酸残基取代的突变，
第323位甘氨酸残基被另一个氨基酸残基取代且第358位丝氨酸残基被另一个氨基酸残基取代的突变，
第344位苏氨酸残基被另一氨基酸残基取代的突变，
第250位谷氨酸残基被另一氨基酸残基取代的突变，
第346位谷氨酸残基被另一氨基酸残基取代且第374位亮氨酸残基被另一个氨基酸残基取代的突变，
第250位谷氨酸残基被另一氨基酸残基取代且第364位苏氨酸被另一氨基酸残基取代的突变，
第202位天冬氨酸残基被另一氨基酸残基取代且第321位丝氨酸残基被另一氨基酸残基取代的突变，
第283位精氨酸残基被另一氨基酸残基取代，第333位丙氨酸残基被另一氨基酸残基取代，第338位丝氨酸残基被另一氨基酸残基取代，第346位谷氨酸残基被另一氨基酸残基取代且第414位天冬氨酸残基被另一氨基酸残基取代的突变，或者是第318位甲硫氨酸残基被另一氨基酸残基取代，第321位丝氨酸残基被另一氨基酸残基取代，第328位缬氨酸残基被另一氨基酸残基取代，第349位缬氨酸残基被另一氨基酸残基取代且第405位谷氨酸残基被另一氨基酸残基所取代。
2、权利要求1所述DNA，其中所述的突变位点是天冬氨酸激酶的318位甲硫氨酸的残基被异亮氨酸残基所取代且第323位甘氨酸残基被天冬氨酸残基所取代，
第325位亮氨酸残基被苯丙氨酸残基所取代且第347位缬氨酸残基被甲硫氨酸残基所取代的突变，
第323位甘氨酸残基被天冬氨酸残基取代且第347位缬氨酸残基被甲硫氨酸残基所取代的突变，
第325位亮氨酸残基被苯丙氨酸残基所取代且第345位丝氨酸残基被亮氨酸残基所取代的突变，
第323位甘氨酸残基被天冬氨酸残基所取代且第358位丝氨酸残基被亮氨酸残基所取代的突变，
第344位苏氨酸残基被甲硫氨酸残基所取代的突变，
第250位谷氨酸残基被赖氨酸残基所取代的突变，
突变由346位谷氨酸残基被赖氨酸残基取代，且374位亮氨酸残基被苯丙氨酸残基取代所造成，
突变由250位谷氨酸残基被赖氨酸残基取代，且364位苏氨酸残基被甲硫氨酸残基取代造成，
突变由202位天冬氨酸残基被甘氨酸残基取代且第321位丝氨酸残基被脯氨酸残基取代造成，
突变是第283位精氨酸残基被丝氨酸残基取代，第333位丙氨酸残基被苏氨酸残基取代，
第338位丝氨酸残基被苏氨酸残基取代，
第346位谷氨酸残基被天冬氨酸残基取代，
第414位天冬氨酸残基被丝氨酸残基取代，
或者，突变是第318位甲硫氨酸残基被赖氨酸残基取代，第321位丝氨酸残基被脯氨酸残基取代，第328位缬氨酸残基被苯丙氨酸残基取代，第349位缬氨酸残基被甘氨酸残基取代且第405位谷氨酸残基被缬氨酸残基取代。
3、一种重组DNA，该重组DNA通过将权利要求1的DNA连接到可以在埃希氏杆菌属细菌细胞内自我复制的载体上而制得。
4、一种含有权利要求1所述DNA的埃希氏菌属的微生物。
5、一种生产L-氨基酸的方法，该方法包括在培养基中培养能够在发酵培养基中生产L-氨基酸的权利要求4所述的微生物，在所述的所述培养物中产生并积累L-氨基酸，并从培养物中收集L-氨基酸。
6、权利要求5所述的方法，所述L-氨基酸为L-赖氨酸或L-苏氨酸。”
针对上述专利权，长春大合生物技术开发有限公司（下称请求人）于2008年8月22日向专利复审委员会提出专利权无效宣告请求，认为本专利不符合专利法第26条第3、4款、专利法第22条第3款以及专利法实施细则第20条第1款的规定。请求人同时提交了以下证据：
证据1：公开号为WO9516042的专利文献，公开日为1995年6月15日，英文，复印件共100页。
请求人认为：（1）本专利权利要求1限定了要求保护的DNA中所含有的编码区突变，但突变之间的关系模糊不清，无法确定所述突变之间究竟是“或”还是“和”的关系；权利要求3是产品权利要求，但没有用结构特征来限定要求保护的产品，只限定了该产品的制备方法，而且本领域技术人员无法确定其中的“载体”的具体含义和其所涵盖的范围；因此，权利要求1、3以及直接或间接地引用权利要求1的权利要求4-6均不清楚，不符合专利法实施细则第20条第1款的规定。（2）本专利的核心内容是含有突变的编码埃希氏杆菌属天冬氨酸Ⅲ（AKⅢ）的DNA，专利权人并未将其制备的含有所述DNA序列的菌株进行保藏，而上述菌株是公众不能得到的生物材料，因此，本专利不符合专利法第26条第3款的规定。（3）权利要求1中限定的“埃希氏杆菌属细菌”和“另一氨基酸残基”的范围过宽，这种概括超出了说明书公开的范围，不符合专利法第26条第4款的规定；从属权利要求2也未对权利要求1中的“埃希氏杆菌属细菌”作进一步限定，且权利要求2中共限定了15种具体突变，其中第11―14种突变在说明书中找不到任何依据，因此权利要求1、2以及直接或间接地引用权利要求1的权利要求3-6均得不到说明书的支持，不符合专利法第26条第4款的规定。（4）证据1明确而具体的公开了本专利权利要求1和2中一些具体突变，本领域技术人员在此基础上，很容易想到将不同的突变组合在一个编码天冬氨酸Ⅲ的DNA中，从而获得本专利权利要求1和2的技术方案。因此，本专利权利要求1和2的技术方案不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定；在此基础上，从属权利要求3―6也不具备创造性。
经形式审查合格后，专利复审委员会受理了上述无效宣告请求案（下称4W02239无效案），并于2008年8月25日向双方当事人发出《无效宣告请求受理通知书》，并将《专利权无效宣告请求书》及其附件副本转送给专利权人，要求其在指定的期限内答复，同时成立合议组对本无效宣告请求案进行审理。
2008年9月22日，请求人提交了补充意见陈述以及证据1的中文译文（复印件共58页）。除了坚持其在无效宣告请求书中的理由外，请求人进一步陈述了如下意见：（1）从本专利的说明书可以看出，虽然专利权人声称可以用本发明的DNA转化埃希氏杆菌属细菌，但实施例中仅仅使用了特定的大肠杆菌菌株，本领域技术人员公知，不同微生物的生理、生化特征差异很大，即便在同一属内也是如此，如果不经过实验验证，本领域技术人员根本无法预测属于埃希氏杆菌的所有细菌都能够作为本发明的宿主细胞来使用。即便就大肠杆菌本身而言，如果技术人员得不到转化后的最终菌株，也无法仅仅根据说明书的描述而预先确定其效果。因此，权利要求1中限定的“埃希氏杆菌属细菌”的范围过宽，得不到说明书的支持。此外，本专利实施例中仅公开了一些具体的突变，没有实验表明此特定位置上用任何其它氨基酸进行取代都能解决本发明的技术问题。本领域技术人员已知，基因序列中具体的突变会产生何种效果是很难预测的，即便在同一个氨基酸位点上，从某种取代突变所能达到的效果也无法预测其它取代也能够达到同样的效果。所以，权利要求1中将本发明的DNA所包含的突变限定为某个位置的氨基酸被“另一氨基酸残基”取代的范围过宽，这种概括超出了说明书公开的范围，不符合专利法第26条第4款的规定。（2）证据1公开了使天冬氨酸激酶Ⅲ对L－赖氨酸反馈抑制脱敏的突变可以是用异亮氨酸残基取代318位甲硫氨酸残基的突变、天冬氨酸残基取代第323位甘氨酸残基的突变、苯丙氨酸残基取代第325位亮氨酸残基的突变、甲硫氨酸残基取代第347位缬氨酸残基的突变、天冬氨酸残基取代第323位甘氨酸残基的突变、甲硫氨酸残基取代第347位缬氨酸残基的突变、苯丙氨酸残基取代第325位亮氨酸残基的突变以及用亮氨酸残基取代第345位丝氨酸残基的突变。本领域技术人员在此基础上，很容易想到将不同的突变组合在一个编码天冬氨酸Ⅲ的DNA中，从而获得本专利权利要求1和2的第一、二、三和四组突变的技术方案。因此，本专利权利要求1和2不具备创造性，在此基础上，从属权利要求3―6也不具备创造性。
专利权人于2008年10月9日提交了意见陈述书、修改的权利要求书和以下反证：
反证1：Methods in enzymology, 第211卷， David M.J. Lilley等主编，1992年出版，封面页、扉页、出版信息页、目录页及第3页―第20页，英文，复印件共24页及其中文译文2页。
反证2：Site-directed mutagenesis, Paul CARTER, The Biochemical Journal，第237卷，第1期，1986年7月1日，封面页、扉页、目录页，第1－7页，英文，复印件共12页及其中文译文共2页。
反证3：微生物国际保藏证明材料及其中文译文，复印件共16页。
专利权人提交的修改后的权利要求书为：
“1、一种编码埃希氏杆菌属细菌天冬氨酸激酶Ⅲ的DNA，该DNA含有编码区的突变以消除所述天冬氨酸激酶的赖氨酸反馈抑制，
所述突变是：
天冬氨酸激酶Ⅲ的318位甲硫氨酸残基被异亮氨酸残基所取代且第323位甘氨酸残基被天冬氨酸残基所取代的突变，
所述酶的第325位亮氨酸残基被苯丙氨酸残基所取代且第347位缬氨酸残基被甲硫氨酸残基所取代的突变，
所述酶的第323位甘氨酸残基被天冬氨酸残基取代且第347位缬氨酸残基被甲硫氨酸残基所取代的突变，
所述酶的第325位亮氨酸残基被苯丙氨酸残基所取代且第345位丝氨酸残基被亮氨酸残基所取代的突变，
第323位甘氨酸残基被天冬氨酸残基所取代且第358位丝氨酸残基被亮氨酸残基所取代的突变，
第344位苏氨酸残基被甲硫氨酸残基所取代的突变，
第250位谷氨酸残基被赖氨酸残基所取代的突变，
第346位谷氨酸残基被赖氨酸残基取代且第374位亮氨酸残基被苯丙氨酸残基取代的突变，
第250位谷氨酸残基被赖氨酸残基取代且第364位苏氨酸被脯氨酸残基取代的突变，
第202位天冬氨酸残基被甘氨酸残基取代且第321位丝氨酸残基被脯氨酸残基取代的突变，
或者突变是第318位甲硫氨酸残基被赖氨酸残基取代，第321位丝氨酸残基被脯氨酸残基取代，第328位缬氨酸残基被苯丙氨酸残基取代，第349位缬氨酸残基被甘氨酸残基取代且第405位谷氨酸残基被另一氨基酸残基取代。
2、一种重组DNA，该重组DNA通过将权利要求1的DNA连接到可以在埃希氏菌属细菌内自我复制的载体上而制得。
3、一种含有权利要求1所述DNA的埃希氏菌属微生物。
4、一种生产L-氨基酸的方法，该方法包括在培养基中培养能够在发酵培养基中生产L-氨基酸的权利要求3所述的微生物，在所述的所述培养物中产生并积累L-氨基酸，并从培养物中收集L-氨基酸。
5、权利要求4所述的方法，所述L-氨基酸为L-赖氨酸或L-苏氨酸。”
在上述修改的基础上，专利权人认为：（1）本领域技术人员阅读申请文件后完全可以清楚权利要求1中以并列选择的关系列出了12种突变（修改后为11种），它们之间是用“或”连接的。其中几乎每个突变都以“的突变”结尾，每个多重突变中的各突变以“且”连接。另外，说明书第5-6页以标号(a)-(1)的形式列出了同样的12种突变，这种记载也证实了上述突变之间的连接关系，因此权利要求1是清楚的，符合专利法实施细则第20条第1款的规定。权利要求2不仅清楚地限定了重组DNA的结构组成，而且表明权利要求1的DNA是连接在载体上的，这些限定显然是结构特征的限定。此外，本领域技术人员熟知“载体”是一种可以携带和转移DNA的遗传物质序列，任何具有在埃希氏杆菌属细菌细胞中自我复制的DNA载体均可以用于该权利要求的技术方案，因此权利要求2也符合专利法实施细则第20条第1款的规定。（2）权利要求1涉及一种序列明确的DNA，本领域技术人员有许多手段来获得该DNA。例如通过合成或从埃希氏杆菌中分离野生型DNA，然后对该DNA进行重组PCR或定位诱变来获得目标基因或DNA(参见说明书第9页20-25行以及实施例1、2)。反证1和2分别描述了DNA化学合成和定位诱变，其中涉及的技术手段均为本领域技术人员已知，涉及的起始材料是公众可以获得的。因此，权利要求1的技术方案的实现并不依赖于任何特定微生物菌株的保藏，在本发明指出具体的突变位点和方式的基础上，本领域技术人员可以基于公知的方法和可获得的材料实现本发明的技术方案，因此本专利说明书已经充分公开。此外，专利权人已对一些微生物进行了保藏（参见证据3，本专利申请过程中提交的微生物保藏证明），本领域技术人员可以利用这些保藏的微生物方便地、可重复地获得本发明的突变DNA、含有该DNA的载体和微生物。（3）根据说明书的描述，本领域技术人员可以理解权利要求1的DNA是在1号序列所示野生型序列或含有不影响酶活性的其它突变的该AKⅢ基因序列的基础上加上权利要求中指出的特定突变而成。而且，该DNA序列决定了其所编码酶的功能。因此，权利要求1中“埃希氏杆菌属细菌”的表述不会导致权利要求范围过宽的问题。此外，请求人认为原权利要求1中的“另一氨基酸残基”范围过宽，修改后的权利要求1中已经将“另一氨基酸残基”修改为具体的氨基酸残基。因此，请求人关于权利要求1得不到说明书支持的理由不成立。在此基础上，修改后的权利要求2－5也得到说明书的支持。（4）请求人提供的证据1中没有公开权利要求1中的第6-11种突变，因此，权利要求1中第6-11种突变的技术方案与证据1相比具有创造性。虽然证据1中公开了AKⅢ第318、323、325、345、347位的氨基酸突变，但没有公开这些突变的任何组合，本领域技术人员无法预测任何的突变组合会产生什么样的效果，也没有动机将这些突变进行组合。另外，本发明权利要求1中限定的第1-5种突变与对比文件1中公开的单突变相比具有意想不到的效果，即协同增强消除赖氨酸反馈抑制的效果（参见本申请说明书表4），因此权利要求1中关于第1－5种突变的技术方案与证据1相比具有创造性，在此基础上，权利要求2-5也具有创造性。
2008年10月14日，专利复审委员会本案合议组将请求人于2008年9月22日提交的意见陈述书及其附件副本转送给专利权人。
2008年10月21日，本案合议组将专利权人于2008年10月9日提交的意见陈述书以及相关附件副本转送给请求人。
2008年11月7日，本案合议组向双方当事人发出口头审理通知书，定于2009年1月15日对本案进行口头审理。
请求人于2008年12月22日提交了意见陈述书。请求人认为：（1）在专利权人于2008年10月9日提交的修改后的权利要求书中，权利要求2-5（分别对应于原权利要求3-6）直接或间接地引用了权利要求1（原权利要求2），所以实际上新的权利要求2-5直接或间接地引用了原权利要求2，而在原权利要求书中并不存在这样的权利要求。因此，扩大了保护范围，不符合专利法实施细则第68条第1款和审查指南第四部分第三章第4.6.2节的规定。（2）权利要求2仍然没有用结构特征来限定要求保护的产品，且没有对“载体”作出清楚的限定，所以该权利要求不清楚，不符合专利法实施细则第20条第1款的规定。（3）本领域技术人员实施本发明只能依据说明书中对诱变方法的记载，这种诱变方法涉及公众不能得到的生物材料，而专利权人未将其提交保藏，同时专利权人提交的反证1和2并没有记载如何获得本专利的DNA，因此本专利说明书公开不充分。（4）从大肠杆菌AKⅢ的研究结果并不能概括到整个“埃希氏杆菌属细菌”。因为本领域技术人员不了解其他种的AKⅢ与大肠杆菌的相似程度，他们的序列、生化性质、受赖氨酸反馈抑制情况都可能有很大差异，无法作出所述概括。例如，就序列而言，同一种酶在同一属的不同种内常常会存在序列上的差异，比如大肠杆菌的第318位是甲硫氨酸，其他种的AKⅢ在该位置很可能并不是甲硫氨酸。此外，专利权人声称权利要求1涉及一种具有明确序列的DNA，但权利要求1并未限定具体DNA序列，仅仅限定了突变位点。因此权利要求1得不到说明书的支持。（5）证据1中已经公开了AKⅢ中第318、323、325、345和347位的氨基酸突变及其消除AKⅢ反馈抑制的效果，本领域技术人员容易想到将这些突变组合在同一个编码AKⅢ的DNA中，以达到更好的消除反馈抑制的效果，也能够预期突变组合达到的效果会比单个突变的简单加和要好。因此权利要求1－5均不具备创造性。
专利权人也于2008年12月22日提交了意见陈述书，其中针对请求人2008年9月22日提交的补充意见进一步陈述了意见，除在先意见陈述中的理由外，对于有关专利法第26条第4款的理由，专利权人还作了如下补充：本专利权利要求1保护的是一种DNA，并不涉及宿主细胞的特征。因此，请求人的上述理由与权利要求1是否得到说明书的支持无关。而且将目的DNA转化到宿主微生物中以实现目的DNA的表达是本领域技术人员的公知常识。而且，现有技术中已经公开了可以用埃希氏杆菌属微生物作为含有突变AKⅢ基因的宿主微生物。另外，“属”是在包括界、门、纲、目、科、属、中的生物学分类中很低的分类，同一属的微生物具有许多的共同特性。本领域技术人员没有理由质疑将来自埃希氏杆菌细菌的权利要求1的DNA引入同属细菌中的技术效果。请求人没有提供实质性的证据来证明大肠杆菌以外的埃希氏杆菌属细菌不能用作本发明中的宿主细胞。
2008年12月30日，本案合议组分别将请求人及专利权人2008年12月22日提交的意见陈述书当面转送给对方当事人。
针对W402239无效宣告请求案的口头审理于2009年1月15日如期进行，双方当事人均委托代理人参加了口头审理。在口头审理过程中，合议组对请求人提出的无效理由和事实进行了调查，双方当事人充分陈述了意见。口头审理中认定的事实如下：
（1）合议组当庭告知双方当事人，专利权人于2008年10月9日提交的修改的权利要求书符合无效程序中权利要求修改的有关规定，本案的审理以专利权人修改后的权利要求书为基础。（2）请求人明确其请求专利权无效宣告的理由和范围是：针对权利要求1－5，本专利说明书不符合专利法第26条第3款的规定；权利要求1-5不符合专利法第26条第4款规定；权利要求2不符合专利法实施细则第20条第1款的规定；权利要求1-5相对于证据1不符合专利法第22条第3款的规定。（3）专利权人不认可证据1的真实性，认可证据1中文译文的准确性；请求人对于反证1－3的真实性、合法性和关联性均没有异议，并认可反证1-3中文译文的准确性。（4）合议组当庭告知双方当事人可以在庭审结束后两周内提交针对口头审理调查内容的书面意见，但不接受新的理由和证据。
2009年2月1日，请求人再次提交了意见陈述书。请求人认为：（1）专利权人修改的权利要求2-5的技术方案未记载在原专利中，扩大了原专利的保护范围，不符合专利法实施细则第68条第1款的规定。（2）权利要求2未用结构限定产品且对“载体”限定不清楚，不符合专利法实施细则第20条第1款的规定。（3）专利权人未保藏本专利中随机诱变获得的突变位点组合的生物材料，且说明书多处记载含义不清楚或错误的术语，而未记载所要求的有益效果，致使本专利的说明书不符合专利法第26条第3款的规定。（4）由于说明书公开不充分且从大肠杆菌AKIII的研究结果不能概括到整个“埃希氏杆菌属细菌”，所以权利要求1-5得不到说明书支持，不符合专利法第26条第4款的规定。（5）证据1中公开单位点突变与本专利组合突变所达到技术效果相同，本领域技术人员很容易想到对证据1中单位点突变组合在同一个AKIII基因中，而且将功能相同的单位点突变组合在一起实现相同的功能是显而易见的，组合后数据只需用常规测定方法就能获得，因此，权利要求1-5不符合专利法第22条第3款规定创造性。
2009年2月1日，专利权人提交了意见陈述书及反证4（编号续前）：标题为“大肠杆菌与埃希氏杆菌属其它细菌的AKⅢ序列比较”，复印件1页。专利权人认为：(1)请求人在其2008年12月22日的意见陈述和口头审理当庭提出的关于“埃希氏杆菌属细菌”因为不同细菌序列之间的差异而得不到说明书的支持的理由超出了法定期限，不应予以审理。就实体而言，请求人这一新的理由也是不能成立的，本专利说明书中已经证实了大肠杆菌AKⅢ酶一些位点氨基酸残基突变的技术效果，即消除赖氨酸的反馈抑制。而大肠杆菌是埃希氏杆菌属细菌的典型代表。而且，同一属细菌之间的形态、形状和遗传上都有很高的相似性。特别对于参与氨基酸合成的关键酶，从进化理论上相似性更高。因此，虽然权利要求1的DNA并不限于SEQ ID NO:1的序列，但由于同属细菌间这种高相似性，不同细菌DDPS酶的序列将具有很高的同源性。因此本领域技术人员完全可以合理预测，埃希氏杆菌属其它种的细菌也可以实现类似的效果。例如，就专利权人所知，另一种埃希氏杆菌属细菌E. albertii与大肠杆菌K-12之间DDPS酶序列的相同性为97.3％。而且本专利中需要突变的位点的氨基酸残基完全一致。因此本专利权利要求1中所述的埃希氏杆菌属细菌得到说明书的支持。（2）本领域技术人员在说明书公开内容的技术上利用所保藏的微生物质或公众可以获得的其他微生物容易获得本发明突变的DNA，本专利符合专利法关于充分公开的要求，而不必将最终的DNA进行保藏。（3）相对于证据1中的单突变，本专利赖氨酸产率提高的效果表明本专利的突变在提高反馈抑制脱敏程度的同时很好保护了酶的比活性和稳定性，因此，本专利中的四个突变具有创造性。
2009年4月15日，针对本专利授权文本，上述请求人再次提出专利权无效宣告请求。请求人认为：（1）本专利权利要求1、2和说明书第3－5页中的“374位亮氨酸”与原始申请文件中相应的表述“347位亮氨酸”不一致，也不能由原始申请文件直接地、毫无疑义地确定，因此上述修改超出了原始申请文件的范围，不符合专利法第33条的规定。（2）本专利说明书没有记载权利要求1的AKⅢ基因生产氨基酸的实施例，因此没有证明本专利权利要求1-6的技术方案的有益效果。未对说明书作出清楚完整的说明，不符合专利法第26条第3款的规定。
经形式审查合格后，专利复审委员会受理了上述无效宣告请求案（下称4W02542无效案），并于2009年5月12日向上述请求人和专利权人发出《无效宣告请求受理通知书》，并将本次专利权无效宣告请求书及其附件副本转送给专利权人，要求其在指定的期限内答复，同时将本次专利权无效宣告请求案转给上述合议组。
2009年5月15日，请求人提交了意见陈述书和以下证据：
证据2：WO9411517国际公开文本，公开日为1994年5月26日，英文，复印件65页，及其中文译文36页。
证据3：WO9516042国际公开文本，公开日为1995年6月15日，英文，复印件103页，及其中文译文74页。
除了坚持其在无效宣告请求书中的理由外，请求人补充了如下意见：（1）本专利权利要求1中涉及AKⅢ第6-11种突变的组合均为通过不能再现的随机诱变方法获得的，但是含有所述突变位点组合的生物材料均未进行保藏。第1-5种突变位点组合虽然是通过扩增和酶切连接方法获得的，但是制备这些突变位点组合的起始材料pLYSC2*48、pLYSC2*117、pLYSC2*126、pLYSC2*150和pLYSC2*158的制备方法在本专利说明书和说明书引用的文献（证据2和3）中均没有公开。因此本领域技术人员无法获得本专利要求保护的DNA，本专利没有充分公开权利要求1-5的技术方案。（2）本专利说明书第12页第16行的“pLYSC*180”、第12页第19行的“pLLC*8”、第12页第26行的“pLYS1*48”、第16页第15行的“pLYSC工作母体”、第17页第6行的“pLYSC2*117”、“pLYSC2*150”和“pLYSC2*158”在引述文件中没有记载;第16页第16行的“引物束”、第17行的“22末端”、第18行的“PllC19片段”、第20行的“PLLC19片段”、第17页第8行“即用所得到的单基因突变型LysC的突变中心附近的SspI裂解位点，及pUC19的lysC下游的SspI裂解位点”、第17页第20－25行“pLYSC2*126做模板扩增含有两个突变位点的DNA片段，将序列表No.7所示的寡核苷酸作为引物及上面提到的试剂盒”、附图中的“lacZ”含义不清；序列表中没有序列1、2和3的序列；说明书第16页表3结果及第18页表4结果与证据1（图4）及证据2（图6）中结果相互矛盾。上述问题导致说明书不清楚、不完整。（3）说明书中没有记载体现本专利权利要求1的AKⅢ基因生产氨基酸的效果的实施例，只是使用了在体外测定的酶活性来证明本发明的效果；而且，说明书中提供的氨基酸产量与酶活性数据之间存在相互矛盾和冲突之处，无法用于证明本专利技术方案的预期效果。综上所述，本专利说明书公开不充分，不符合专利法第26条第3款的规定。
2009年6月15日，合议组将请求人于2009年5月15日提交的意见陈述书以及相关附件副本转送给专利权人。
2009年6月26日，专利权人提交了意见陈述书，同时提交了与专利权人在4W02239无效案中提交的修改后的权利要求书相同的权利要求书以及如下反证：
反证4：WO9516042国际公开文本，公开日为1995年6月15日，英文，复印件103页，及其中文译文74页。
专利权人认为：（1）原始申请文件中记载的“347位亮氨酸”是参照序列表中1号序列所示的AKⅢ序列而言的，而序列表中347位氨基酸残基为缬氨酸，而非亮氨酸，因此，原始记载的“347位亮氨酸”显然是错误的。而说明书表2中记载的这一突变为“374位亮氨酸被取代为苯丙氨酸”，这里“374位亮氨酸”的记载与序列表一致。本领域技术人员在认识到“347位亮氨酸”属于明显错误的基础上，结合上述实施例记载的内容，可以直接地、毫无疑义地确定其正确表述应该是“374位亮氨酸”。（2）本专利要求保护的技术方案的基本技术效果是消除L－赖氨酸对埃希氏杆菌属细菌AKⅢ的反馈抑制，说明书实施例1和2已经证明了权利要求中所述的每种突变的消除L－赖氨酸反馈抑制的效果，其中给出了具体的实验数据。基于现有技术，本领域技术人员明了消除埃希氏杆菌属细菌AKⅢ的L－赖氨酸反馈抑制将会提高L－赖氨酸的产量（例如，参见反证4）。实施例3和4表明本发明的AKⅢ与现有技术中的突变相比导致更好的L－赖氨酸产量。实施例5证明了含有本专利突变的菌株在苏氨酸的生产中受到赖氨酸的反馈抑制较小，从而在苏氨酸的生产中具有优势。本领域技术人员由此完全可以确认本专利AKⅢ突变的效果。本专利说明书符合专利法第26条第3款的规定。
2009年7月20日，专利复审委员会向请求人发出转送文件通知书，将专利权人2009年6月26日提交的意见陈述书和相关附件转送给请求人。
2009年7月30日，专利权人提交了意见陈述书及其在4W02239无效案中于2008年10月9日提交的反证1－3。
针对请求人于2009年5月15日提交的补充意见，专利权人指出：（1）请求人在其补充意见中提出的理由为本专利的DNA的获得依赖于生物材料的保藏而专利权人未对其进行适当的保藏。该理由以及所依据的事实请求人曾在针对本专利的另一无效请求案W402239中提出过，且复审委已经对此进行了审理，请求人依据同样的事实和理由针对同一专利重复提出无效请求显然是不恰当的。但专利权人仍重申其在W402239无效案中的意见。（2）根据本专利说明书第12页第15－26行记载的内容，本领域技术人员可以理解，说明书第12页第16行的“pLYSC*180”应为“pLYSC1*80”、第12页第19行的“pLLC*8”应为“pUC18”、第12页第26行的“pLYS1*80”应为“pLYSC1*80”；根据说明书第16－17页的记载，第16页第15行的“pLYSC工作母体”应理解为“pLYSC作为模板”、第17页第6行的“pLYSC2*117”应为“pLYSC1*117”、“pLYSC2*150”和“pLYSC2*158”分别为“pLYSC1*150”和“pLYSC1*158”;第16页第16行的“引物束”应为“作为引物来引入突变”、第17行的“22末端”应为“双末端”、第18行和20行的“PllC19片段”应为“PUC19片段”、第17页第8行的内容表示利用两个SspI酶切位点将两个单突变基因组合成双突变基因；第17页第20－25行的内容表明在pU1823D的构建中使用了上文提到的试剂盒、以pLYSC2*126作为模板和以序列号7的寡核苷酸作为引物、附图中的“lacZ”是一种启动子的名称，因此“lacZ引物”应为“lacZ启动子”；序列表中列出了1、2和3号序列，只是缺少相应的标号而已；说明书第16页表3结果及第18页表4结果与证据1（图4）及证据2（图6）中结果并无矛盾。本专利说明书是清楚完整的，符合专利法第26条第3款的规定。
2009年8月11日，专利复审委员会将专利权人于2009年7月30日提交的意见陈述书及其所附附件转送给请求人。
请求人于2009年9月4日提交了意见陈述书。其中进一步陈述了本专利不符合专利法第33条以及专利法第26条第3款规定的理由。
2009年9月14日，本案合议组向双方当事人发出口头审理通知书，定于2009年10月12日对本案进行口头审理。
2009年9月28日，专利复审委员会向专利权人发出转送文件通知书，将请求人于2009年9月4日提交的意见陈述书转送给专利权人。
针对W402542无效宣告请求案的口头审理于2009年10月12日如期进行，双方当事人均委托代理人参加了口头审理。在口头审理过程中，合议组将请求人于2009年9月4日提交的意见陈述书当庭转送给专利权人。专利权人当庭提交了修改的权利要求书，其中相对于其于2009年6月26日提交的修改的权利要求书而言删除了权利要求1以及权利要求5中的部分并列技术方案，修改后的权利要求书如下：
“1、一种编码埃希氏杆菌属细菌天冬氨酸激酶Ⅲ的DNA，该DNA含有编码区的突变以消除所述天冬氨酸激酶的赖氨酸反馈抑制，
所述突变是：
天冬氨酸激酶Ⅲ的318位甲硫氨酸残基被异亮氨酸残基所取代且第323位甘氨酸残基被天冬氨酸残基所取代的突变，
所述酶的第325位亮氨酸残基被苯丙氨酸残基所取代且第347位缬氨酸残基被甲硫氨酸残基所取代的突变，
所述酶的第323位甘氨酸残基被天冬氨酸残基取代且第347位缬氨酸残基被甲硫氨酸残基所取代的突变，
所述酶的第325位亮氨酸残基被苯丙氨酸残基所取代且第345位丝氨酸残基被亮氨酸残基所取代的突变，
第250位谷氨酸残基被赖氨酸残基所取代的突变，
第250位谷氨酸残基被赖氨酸残基取代且第364位苏氨酸被脯氨酸残基取代的突变，或者
第202位天冬氨酸残基被甘氨酸残基取代且第321位丝氨酸残基被脯氨酸残基取代的突变。
2、一种重组DNA，该重组DNA通过将权利要求1的DNA连接到可以在埃希氏菌属细菌内自我复制的载体上而制得。
3、一种含有权利要求1所述DNA的埃希氏菌属微生物。
4、一种生产L-氨基酸的方法，该方法包括在培养基中培养能够在发酵培养基中生产L-氨基酸的权利要求3所述的微生物，在所述的所述培养物中产生并积累L-氨基酸，并从培养物中收集L-氨基酸。
5、权利要求4所述的方法，所述L-氨基酸为L-赖氨酸。”
口头审理过程中，合议组当庭将上述修改后的权利要求书转送给请求人，请求人对其修改时机及修改内容没有提出异议。
合议组对请求人提出的无效理由和事实进行了调查，双方当事人充分陈述了各自的意见。本次口头审理中认定的事实如下：
（1）请求人当庭放弃了有关本专利不符合专利法第33条的无效宣告请求理由，并确认其无效宣告请求的理由和范围是：针对修改后的权利要求1－5，本专利说明书不符合专利法第26条第3款的规定。（2）专利权人对于证据2、3的真实性、合法性和关联性以及中文译文的准确性均无异议。请求人对于反证4的真实性、合法性、关联性、译文准确性均无异议。（3）合议组当庭告知双方当事人，本专利的申请日在2009年10月1日之前，根据《施行修改后的专利法的过渡办法》和《施行修改后的专利法实施细则的过渡办法》，对于创造性问题，本专利权无效宣告请求案适用2000年8月25日第二次修订的专利法第22条第3款（下称原专利法第22条第3款），对于支持、清楚及公开问题，适用2008年12月27日第三次修订的专利法第26条第3、4款。
此外，双方当事人可以在口审结束后十日内提交针对口头审理调查内容的书面意见，但不接受新的理由和证据。
2009年10月19日，请求人提交了意见陈述书。其中进一步陈述了本专利不符合专利法第26条第3款的规定的理由。
2009年10月19日，专利权人也提交了意见陈述书。专利权人认为本专利说明书符合专利法第26条第3款的规定。
至此，合议组认为本专利权无效请求案事实已经清楚，可以依法作出审查决定。
二、决定的理由
（一）关于审查文本
在本无效宣告请求案的审理过程中，专利权人主张的权利要求书是其于2009年10月12日对W402542无效宣告请求案进行口头审理的过程中修改的权利要求书。对此修改，请求人未提出任何异议。合议组经审查，认为该权利要求书的修改符合专利法及其实施细则和审查指南的相关规定，因此，本无效宣告请求的审查文本为：专利权人于2009年10月12日提交的修改的权利要求1-5和本专利授权公告的说明书及其附图和摘要。
（二）专利权无效宣告请求的理由、范围和证据
根据请求人在上述两个请求中的确认，其请求宣告本专利权无效的理由及其范围是：针对修改的权利要求1－5，本专利说明书不符合专利法第26条第3款的规定；权利要求1-5不符合专利法第26条第4款有关权利要求应当得到说明书支持的规定；权利要求2不符合专利法第26条第4款有关权利要求应当清楚（原专利法实施细则第20条第1款）的规定；权利要求1-5相对于证据1不符合专利法第22条第3款的规定。
在针对W402239无效宣告请求案的口头审理过程中，专利权人不认可证据1的真实性。对此，合议组认为，证据1是公开号为WO9516042的专利文献，经在专利数据库中核实，合议组认可证据1的真实性。其公开日在本专利的优先权日之前，可以用于评价本专利的创造性。请求人对于反证1－3的真实性、合法性和关联性均没有异议。因此合议组认可反证1－3的真实性、合法性和关联性。根据双方当事人的确认，证据1的中文译文以请求人提交的为准，反证1―3的中文译文以专利权人提交的为准。
在W402542无效宣告请求案中，专利权人对于证据2、3的真实性、合法性和关联性以及中文译文的准确性均无异议。请求人对于反证4的真实性、合法性、关联性、译文准确性无异议。合议组在此予以确认。根据双方当事人的确认，证据2、3的中文译文以请求人提交的为准，反证4的中文译文以专利权人提交的为准。
（三）关于专利法第26条第4款有关权利要求书应得到说明书支持的规定
专利法第26条第4款规定：权利要求书应当以说明书为依据，清楚、简要地限定要求专利保护的范围。
权利要求书应当以说明书为依据，是指权利要求书应当得到说明书的支持。权利要求书中的每一项权利要求所要求保护的技术方案应当是所属技术领域的技术人员能够从说明书中公开的内容得到或者概括得出的技术方案，并且不得超出说明书公开的范围。如果权利要求的概括包含申请人推测的内容，而其效果又难于预先确定和评价，应当认为这种概括超出了说明书公开的范围。
在4W02239无效宣告请求案中，请求人认为，本专利实施例中所做的所有实验都仅仅使用了特定的大肠杆菌菌株，本领域技术人员无法预测属于埃希氏杆菌的所有细菌都能够作为本发明的宿主细胞使用，因此权利要求1―5中限定的“埃希氏杆菌”范围过宽，得不到说明书的支持。此外，本领域技术人员并不了解其它埃希氏杆菌属细菌与大肠杆菌AKⅢ在序列、生化性质、受赖氨酸反馈抑制情况的相似程度，同一种酶在同一属内的不同种内常常会有序列上的差异，从大肠杆菌的AKⅢ并不能概括到整个“埃希氏杆菌属细菌”，因此权利要求得不到说明书的支持。
专利权人认为，现有技术中已经公开了可以用埃希氏杆菌属微生物作为含有突变AKⅢ基因的宿主微生物。另外，“属”是在包括界、门、纲、目、科、属、中的生物学分类中很低的分类，同一属的微生物具有许多的共同特性。本领域技术人员没有理由质疑将来自埃希氏杆菌细菌的权利要求1的DNA引入同属细菌中的技术效果。而且本专利说明书中已经证实了大肠杆菌AKⅢ酶一些位点氨基酸残基突变的技术效果，即消除赖氨酸的反馈抑制。而大肠杆菌是埃希氏杆菌属细菌的典型代表。同一属细菌之间的形态、形状和遗传上都有很高的相似性。因此，虽然权利要求1的DNA并不限于SEQ ID NO:1的序列，但由于同属细菌间这种高相似性，不同细菌DDPS酶的序列将具有很高的同源性。本领域技术人员完全可以合理预测，埃希氏杆菌属其它种的细菌也可以实现类似的效果。
对此，合议组认为：（1）本领域技术人员已知，埃希氏杆菌属包括多种不同的菌种，每一菌种又有多种不同的菌株。不同菌种、甚至相同菌种的不同菌株间均具有不同的特性，其中的某些基因序列也存在一定差异，在大肠杆菌中的AKⅢ序列中特定功能的某种突变在其他埃希氏杆菌属细菌中是否存在或是否表达出来并不清楚，从而无法预期权利要求中所述的氨基酸位点发生取代突变后，能够实现所述的对L－赖氨酸反馈抑制具有脱敏突变的功能。（2）虽然本专利利用转基因方式获得了导入特定突变的AKⅢ的对L赖氨酸反馈抑制脱敏的菌株，例如，实施例3、4用导入了突变的大肠杆菌DDPS基因和突变AKⅢ的菌株来生产L－赖氨酸，其中采用的菌株均为已知的大肠杆菌菌株B-399（参见说明书第27页第1行－第19页第2017行，表5、6）；实施例5用含有突变型AKⅢ的菌株生产L苏氨酸，其中采用的宿主均为大肠杆菌B-3996。然而，本专利实施例中仅记载了用导入含突变大肠杆菌DDPS和/或AKⅢ的质粒的大肠杆菌特定菌株，同时验证了采用本专利的方法制备的特定菌株的生产氨基酸的能力，但并非属于埃希氏杆菌属的任何AKⅢ序列以及任何菌株在采用本专利的方法进行转化后均可以实现本发明预期的技术效果。现有技术中也没有关于上述菌属的微生物都可以采用转基因方法获得上述功能的记载。综上所述，在本专利说明书实施例中仅使用了特定的AKⅢ序列以及具体菌株进行了试验并验证其试验效果的情况下，本领域技术人员根据本专利说明书的描述尚不能预见所有属于埃希氏杆菌属都可以通过导入本发明的突变的AKⅢ而提高其生产L－氨基酸的产量，权利要求1的概括包含了专利权人推测的内容，而其效果又难于预先确定和评价，应当认为这种概括超出了说明书公开的范围。专利权人可以对权利要求进行概括，获得与说明书公开的内容相适应的保护范围，但仅限于根据说明书充分公开的内容进行合理的概括。综上所述，本领域技术人员基于其掌握的公知常识以及对现有技术的认识，可以判断权利要求1-5概括的范围超出了说明书公开的范围，其中包含了专利权人推测的内容。因此，专利权人认为本专利权利要求1-5符合专利法第26条第4款规定的理由不成立。
此外，专利权人还认为，请求人于2008年12月22日提交的意见陈述书中陈述的关于“埃希氏杆菌属细菌”因为不同细菌序列之间的差异而得不到说明书的支持的理由超出了举证期限，不应予以审理。
对此，合议组认为，一方面，请求人在举证期限内的2008年9月22日提交的意见陈述书中，针对支持问题曾提出：本领域技术人员已知，基因序列中具体的突变产生何种效果是很难预测的，即使在同一个氨基酸某种取代突变所能达到的效果也无法预测其它取代也能够达到同样的效果。另一方面，专利权人于2008年10月9日提交的针对无效宣告请求书的意见陈述中认为，权利要求1涉及一种具有特定序列的DNA，该序列本身已经足以确定该DNA，而且该DNA序列决定了其所编码酶的功能。在上述程序的基础上，请求人于2008年12月22日提交的意见陈述中认为：专利权人声称权利要求1涉及一种具有明确序列的DNA，但权利要求1并未限定具体DNA序列，仅仅限定了突变位点；本领域技术人员并不了解其他埃希氏杆菌属细菌与大肠杆菌在序列、生化性质、受赖氨酸反馈抑制情况的相似程度，因此从大肠杆菌的AKⅢ不能概括到整个“埃希氏杆菌属细菌”。对上述争议焦点，合议组在口头审理中进行了调查，双方当事人均发表了意见。而且，口头审理结束后，合议组给予专利权人两周的时间针对口头审理的内容补充意见陈述。2009年2月1日，专利权人提交了意见陈述书，其中针对上述问题进一步发表了意见，同时提交了用于证明DDPS在埃希氏杆菌中序列一致性的反证4。在口头审理以及口头审理后提交的意见陈述书中，专利权人均认可权利要求1并不仅仅限于序列1的DNA序列。由上述事实可知，请求人于2008年12月22日提交的意见陈述中涉及“埃希氏杆菌属细菌”因为不同细菌序列之间的差异而得不到说明书的支持的理由并非新的理由，而是针对专利权人的相应意见针对性的答复，应当予以审理。
综上所述，本专利权利要求1―5的技术方案不符合专利法第26条第4款有关权利要求应当得到说明书支持的规定，应被宣告无效。因此，对于上述二案中请求人提出的其他无效宣告请求理由不再予以评述。
基于以上事实和理由，本案合议组作出如下审查决定。
三、决定
宣告第97122854.X号发明专利权无效。
当事人对本决定不服的，可以根据专利法第46条第2款的规定，自收到本决定之日起三个月内向北京市第一中级人民法院起诉。根据该款的规定，一方当事人起诉后，另一方当事人作为第三人参加诉讼。
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