发明创造名称：通过在发酵罐中高密度培养真核微生物来增加含有多烯脂肪酸的脂质的产生
外观设计名称：
决定号：18921
决定日：2012-06-27
委内编号：4W101226
优先权日：2000-01-28
申请（专利）号：01806451.5
申请日：2001-01-26
复审请求人：
无效请求人：张文娟
授权公告日：2009-05-27
审定公告日：
专利权人：马泰克生物科学公司
主审员：卢阳
合议组组长：马文霞
参审员：闫珠君
国际分类号：C12N1/00，C12P7/64
外观设计分类号：
法律依据：专利法第26条第4款
决定要点：权利要求书应当以说明书为依据，是指权利要求书应当得到说明书的支持。权利要求书中的每一项权利要求所要求保护的技术方案应当是所属技术领域的技术人员能够从说明书充分公开的内容得到或者概括得出的技术方案，并且不得超出说明书公开的范围。
全文：
本无效宣告请求涉及申请日为2001年01月26日、优先权日为2000年01月28日、授权公告日为2009年05月27日、名称为“通过在发酵罐中高密度培养真核微生物来增加含有多烯脂肪酸的脂质的产生”的第01806451.5号发明专利权（下称本专利），专利权人为马泰克生物科学公司。本专利授权公告时的权利要求书如下：
“1. 一种从破囊壶菌目微生物生产含有多烯脂肪酸的脂质的方法，所述微生物能产生占其产生的总脂质至少15％的多不饱和脂，该方法包括在含有非醇碳源和限制性营养源的发酵培养基中进行所述微生物的发酵；
其中所述方法包括向包含所述微生物的发酵培养基中添加非醇碳源和限制性营养源，添加的速率足以提高该发酵培养基的生物量密度到基于细胞干重的至少100g/L；且
其中所述具有基于细胞干重至少100g/L生物量密度的培养基发酵产生含有多烯脂肪酸的脂质。
2. 权利要求1的方法，其中所述方法是补料分批方法。
3. 权利要求1的方法，其中所述方法是分批方法或连续方法。
4. 权利要求1的方法，其中当该发酵培养基的生物量密度基于细胞干重为至少100g/L时，添加碳源，不加或很少加入限制性营养源以诱导产生营养限制性条件，该条件可诱导产生脂质。
5. 权利要求1的方法，其中当所述培养基发酵产生含有多烯脂肪酸的脂质时，该发酵培养基的生物量密度基于细胞干重为至少150g/L。
6. 权利要求1的方法，其中总发酵时间为从90小时到100小时，所述发酵培养基中的溶氧水平在前24小时维持在8％，在第24小时到第40小时维持在4％，在第40小时到发酵终点为0.5％或更少。
7. 权利要求1的方法，其中在产生阶段所述发酵培养基中的溶氧水平随微生物生长而减少到1％饱和度或更少。
8. 权利要求1的方法，其中所述非醇碳源包含碳水化合物。
9. 权利要求1的方法，其中所述限制性营养源包含选自氮源，碳源，磷酸盐源，维生素源，痕量金属源，主要金属源，二氧化硅源及其混合物的营养源。
10. 权利要求1的方法，其中所述限制性营养源包含选自痕量金属源和主要金属源的营养源，而痕量金属源和主要金属源选自这些金属的硫酸盐和氯化物和其混合物。
11. 权利要求1的方法，其中所述限制性营养源包含氮源。
12. 权利要求1的方法，其中所述限制性营养源包含无机铵盐。
13. 权利要求1的方法，其中所述限制性营养源包括氢氧化铵。
14. 权利要求1的方法，其中所述发酵培养基的pH由限制性营养源控制。
15. 权利要求1的方法，其中所述发酵培养基的温度至少为20℃。
16. 权利要求1的方法，所述方法中所述微生物产生的总脂质至少15％为多不饱和脂。
17. 权利要求1的方法，所述方法中所述微生物产生的总脂质至少25％为二十二碳六烯酸。
18. 权利要求1的方法，其中该方法以至少0.5g/L/hr的平均速率产生脂质。
19. 权利要求1的方法，其中该方法以至少0.5g/L/hr的平均速率产生脂质，所述脂质的至少15％是多不饱和脂。
20. 权利要求1的方法，其中该方法以至少0.5g/L/hr的平均速率产生脂质，且ω-3和ω-6脂肪酸的总量是所述脂质的至少20％。
21. 权利要求1的方法，其中该方法以至少0.5g/L/hr的平均速率产生脂质，所述脂质的至少25％是二十二碳六烯酸。
22. 权利要求1的方法，其中所述微生物能产生多烯脂肪酸，所述多烯脂肪酸是能在需氧条件下产生的。
23. 权利要求22的方法，其中所述微生物在需氧条件下产生多烯脂肪酸。
24. 权利要求1的方法，其中所述微生物能产生多烯脂肪酸，所述多烯脂肪酸是能在需氧条件下产生的，且其中所述微生物是在补料分批方法中培养。
25. 权利要求24的方法，其中所述微生物在需氧条件下产生多烯脂肪酸。
26. 权利要求1的方法，其中所述微生物选自破囊壶菌属，Schizochytrium及其混合物。
27. 权利要求1的方法，其中所述发酵培养基中的溶氧量受到控制。
28. 权利要求27的方法，其中所述发酵培养基中的溶氧量通过控制发酵罐顶部空间的氧含量或控制该发酵培养基的搅拌速度来控制。
29. 权利要求1的方法，其中该方法以至少0.2g/L/hr的平均速度产生二十二碳六烯酸。
30. 权利要求1的方法，还包括：
(a)除去所述发酵培养基中的水，得到干的微生物；和
(b)从所述干的微生物分离脂质，其中所述微生物脂质的至少15％为多不饱和脂。
31. 权利要求30的方法，其中所述微生物脂质的至少25％为二十二碳六烯酸。
32. 权利要求1的方法，还包括：
(a)处理所述发酵培养基以透化，溶解，或破裂微生物细胞；和
(b)在有或没有试剂帮助裂解脂质/水乳剂的情况下，通过重力分离来回收发酵培养基中的脂质，其中所述微生物脂质的至少15％为多不饱和脂。
33. 权利要求32的方法，其中所述微生物脂质的至少25％为二十二碳六烯酸。
34. 权利要求1的方法，还包括：
(a)不进行提前离心而使水从所述发酵培养基蒸发，从而提供干的微生物；和
(b)从所述干的微生物分离脂质，其中所述微生物脂质的至少15％为多不饱和脂。
35. 权利要求34的方法，其中所述微生物脂质的至少25％为二十二碳六烯酸。
36. 权利要求1的方法，其中在产生阶段所述发酵培养液的溶氧水平低于饱和的3％。
37. 权利要求1的方法，其中在产生阶段所述发酵培养基的溶氧水平低于饱和的1％。
38. 一种从破囊壶菌目微生物生产含有多烯脂肪酸的脂质的方法，所述微生物能产生至少占其生物量20％的脂质，该方法包括在含有碳源和限制性营养源的培养基中进行所述微生物的发酵；
其中所述碳源在补料分批方法中添加到所述发酵培养基中，添加的速率足以提高所述发酵培养基的生物量密度到基于细胞干重的至少100g/L，且
其中所述具有基于细胞干重至少100g/L生物量密度的培养基发酵产生含有多烯脂肪酸的脂质。
39. 权利要求38的方法，其中当所述培养基发酵产生含有多烯脂肪酸的脂质时，该发酵培养基的生物量密度基于细胞干重为至少150g/L。
40. 权利要求38的方法，其中该方法以至少0.5g/L/hr的平均速率产生脂质。
41. 权利要求38的方法，其中所述微生物选自破囊壶菌属，Schizochytrium及其混合物。
42. 权利要求38的方法，其中该方法以至少0.2g/L/hr的平均速度产生二十二碳六烯酸。
43. 一种从破囊壶菌目微生物生产含有多烯脂肪酸的脂质的方法，所述微生物能产生至少占其生物量20％的脂质，该方法包括在含有非醇碳源和限制性营养源的培养基中进行所述微生物的发酵，
其中所述非醇碳源和限制性营养源添加到所述培养基中，添加的速率足以提高该发酵培养基生物量密度到基于细胞干重的至少100g/L，且
其中所述具有基于细胞干重至少100g/L生物量密度的培养基发酵产生含有多烯脂肪酸的脂质。
44. 权利要求43的方法，其中所述方法是补料分批方法。
45. 权利要求43的方法，其中当所述培养基发酵产生含有多烯脂肪酸的脂质时，该发酵培养基的生物量密度基于细胞干重为至少150g/L。
46. 权利要求43的方法，其中该方法以至少0.5g/L/hr的平均速率产生脂质。
47. 权利要求43的方法，其中所述微生物选自破囊壶菌属，Schizochytrium及其混合物。
48. 权利要求43的方法，其中该方法以至少0.2g/L/hr的平均速度产生二十二碳六烯酸。
49. 一种从破囊壶菌目微生物生产含有多烯脂肪酸的脂质的方法，所述微生物能产生占其产生的总脂质至少15％的多不饱和脂，该方法包括在含有碳源和限制性营养源的培养基中进行所述微生物的发酵，
其中所述碳源在补料分批方法中添加到所述发酵培养基中，添加的速率足以提高所述培养基的生物量密度到基于细胞干重的至少100g/L，且
其中所述具有基于细胞干重至少100g/L生物量密度的培养基发酵产生含有多烯脂肪酸的脂质。
50. 权利要求49的方法，其中当所述培养基发酵产生含有多烯脂肪酸的脂质时，该发酵培养基的生物量密度基于细胞干重为至少150g/L。
51. 权利要求49的方法，其中该方法以至少0.5g/L/hr的平均速率产生脂质。
52. 权利要求49的方法，其中所述微生物选自破囊壶菌属，Schizochytrium及其混合物。
53. 权利要求49的方法，其中该方法以至少0.2g/L/hr的平均速度产生二十二碳六烯酸。
54. 培养能生产占其生物量的至少20％为脂质的破囊壶菌目微生物的方法，包括在含有碳源和限制性营养源的培养基中进行所述微生物的发酵，
其中所述碳源和限制性营养源添加到所述培养基中，添加的速率足以提高该发酵培养基的生物量密度到基于细胞干重的至少100g/L，
其中所述具有基于细胞干重至少100g/L生物量密度的培养基发酵产生含有多烯脂肪酸的脂质，
其中该方法生产脂质的速度至少平均为0.5g/L/hr，且
所述微生物产生的总脂质中至少15％是多不饱和脂。
55. 权利要求54的方法，其中所述方法是补料分批方法。
56. 权利要求54的方法，其中当所述培养基发酵产生含有多烯脂肪酸的脂质时，该发酵培养基的生物量密度基于细胞干重为至少150g/L。
57. 权利要求54的方法，其中所述微生物选自破囊壶菌属，Schizochytrium及其混合物。
58. 权利要求54的方法，其中该方法以至少0.2g/L/hr的平均速度产生二十二碳六烯酸。
59. 培养破囊壶菌目微生物的方法，包括在含有碳源和限制性营养源的培养基中进行所述微生物的发酵，
其中所述碳源和限制性营养源添加到所述培养基中，添加的速率足以提高该发酵培养基的生物量密度到基于细胞干重的至少100g/L，
其中所述具有基于细胞干重至少100g/L生物量密度的培养基发酵产生含有多烯脂肪酸的脂质，且
其中所述微生物能生产占其生物量至少20％的包含多烯脂肪酸的脂质。
60. 权利要求59的方法，其中所述方法是补料分批方法。
61. 权利要求59的方法，其中当所述培养基发酵产生含有多烯脂肪酸的脂质时，该发酵培养基的生物量密度基于细胞干重为至少150g/L。
62. 权利要求59的方法，其中该方法以至少0.5g/L/hr的平均速率产生脂质。
63. 权利要求59的方法，其中所述微生物选自破囊壶菌属，Schizochytrium及其混合物。
64. 权利要求59的方法，其中该方法以至少0.2g/L/hr的平均速度产生二十二碳六烯酸。
65. 一种生产微生物脂质的方法，包括：
(a)将碳源和限制性营养源添加到培养破囊壶菌目微生物的发酵培养基中，添加的速率足以提高所述发酵培养基的生物量密度到基于细胞干重的至少100g/L；
(b)提供足以使所述微生物生产所述脂质的发酵条件；
(c)使所述微生物在所述发酵培养基的生物量密度达到基于细胞干重为至少100g/L时生产所述脂质；和
(d)回收所述脂质，其中所述脂质的15％以上是多不饱和脂。
66. 权利要求65的方法，其中所述方法是补料分批方法。
67. 权利要求65的方法，其中当所述培养基发酵产生含有多烯脂肪酸的脂质时，该发酵培养基的生物量密度基于细胞干重为至少150g/L。
68. 权利要求65的方法，其中该方法以至少0.5g/L/hr的平均速率产生脂质。
69. 权利要求65的方法，其中所述微生物选自破囊壶菌属，Schizochytrium及其混合物。
70. 权利要求65的方法，其中该方法以至少0.2g/L/hr的平均速度产生二十二碳六烯酸。
71. 一种生产微生物脂质的方法，包括：
在含有碳源和限制性营养源的培养基中进行破囊壶菌目微生物发酵；
将碳源和限制性营养源添加到发酵培养基中，添加的速率足以提高所 述发酵培养基的生物量密度到基于细胞干重的至少100g/L；
提供足以使所述微生物生产所述脂质的发酵条件；
在所述发酵培养基的生物量密度达到基于细胞干重为至少100g/L时生产脂质；和
回收所述微生物脂质，其中所述微生物脂质的至少15％为多不饱和脂。
72. 权利要求71的方法，其中所述方法是补料分批方法。
73. 权利要求71的方法，其中当所述培养基发酵产生含有多烯脂肪酸的脂质时，该发酵培养基的生物量密度基于细胞干重为至少150g/L。
74. 权利要求71的方法，其中该方法以至少0.5g/L/hr的平均速率产生脂质。
75. 权利要求71的方法，其中所述微生物选自破囊壶菌属，Schizochytrium及其混合物。
76. 权利要求71的方法，其中该方法以至少0.2g/L/hr的平均速度产生二十二碳六烯酸。”
针对上述专利权，张文娟（下称请求人）于2011年10月14日向专利复审委员会提出了无效宣告请求，其理由是权利要求1－76不符合专利法第22条第3款、专利法第26条第4款的规定，请求宣告本专利权利要求全部无效，同时提交了如下证据：
证据1：EP0823475A，公开日为1998年2月11日，复印件共32页，其中文译文33页；
证据2：WO9408467A1，公开日为1994年4月28日，复印件共72页，其中文译文23页；
证据3：US5130242A，公开日为1992年7月14日，复印件共29页，其中文译文32页；
证据4：P.A.E.P Meesters等人，“High-cell-density cultivation of the lipid accumulating yeast Cryptococcus curvatus using glycerol as a carbon source”,Appl Microbial Biotechnol,(1996)45，第575－579页，复印件共5页，其中文译文8页；
证据5：D.Riesenberg R. guthke，“High-cell-density cultivation of microorganisms”，Appl Microbiol Biotechnol，(1995)51,第422-430页，复印件共9页，其中文译文11页；
证据6：《抗生素生产工艺学》，华东华工学院、沈阳药学院合编，化学工业出版社，1982年5月第一版第一次印刷，版权信息页、第118－121页，复印件共5页。
请求人认为：（1）证据1公开了用Schizochytrium属SR21株生产脂质的方法，权利要求1与之相比，区别在于发酵过程中添加非醇碳源和限制性营养源，并将添加非醇碳源和限制性营养源的速率限定至足以提高该发酵培养基的生物量密度到基于细胞干重的至少100g/L，所解决的技术问题是提高生物量密度从而提高多不饱和脂质的生产量。由于证据1还给出了向培养基中添加碳源和氮源以提高生物量密度和多不饱和脂质的生产量的启示，证据4公开了利用酵母菌Cryptococcus curvatus生产脂质的方法，其中给出了利用微生物生产脂质时将生物量密度提高至100g/L生产多烯脂肪酸的启示，根据这些启示，通过向培养基中添加碳源和氮源并控制添加速率至足以提高该发酵培养基的生物量密度到基于细胞干重的至少100g/L，从而提高多不饱和脂质的生产量，对于本领域技术人员来说是显而易见的，因此，权利要求1相对于证据1和4的结合不具有专利法第22条第3款规定的创造性；（2）从属权利要求5将产生脂质时的生物量密度限定为至少150g/L，证据5中公开了多种微生物高密度发酵时生物量密度在100-268g/L，因此权利要求5不具备创造性；（3）从属权利要求4的附加技术特征增加了诱导产生脂质的步骤：在生物密度达到100g/L时，添加碳源，不加或很少加入限制性营养源以诱导产生脂质。证据3公开了一种生产ω-3HUFA的方法，其中给出了在指数期进行营养限制以诱导脂质和ω-3HUFA生产的启示，因此，权利要求4相对于证据1、3、4的结合不具备创造性；（4）从属权利要求6中进一步限定了发酵过程中分阶段控制溶氧水平的具体步骤，证据1中给出了可在培养的早期将发酵培养基中的溶氧水平维持在高水平的启示，证据2中教导了通过在Thraustochytrium、Schizochytrium或其混合物的生长过程中限制发酵培养基中氧的含量可增加脂质的含量，脂质生产的最佳氧浓度可通过变化培养基中氧的含量来确定，并具体公开了培养基中氧的含量低于饱和度的40%，优选在饱和度的5%-40%之间，因此，权利要求6相对于证据1、2、4的结合不具备创造性；（5）从属权利要求18-21、29对脂质产生的速率进行了限定，脂质产生的速率是发明所要达到的效果，不是技术手段，要达到该速率可以采用权利要求4、6的技术方案，因此，在权利要求4、6不具有创造性时，权利要求18-21、29也不具有创造性；（6）从属权利要求8-13、15-17、22-28的附加技术特征都在证据1中公开，从属权利要求2、3、7、14、30-37的附加技术特征对本领域技术人员来说是显而易见的，因此，当其引用的权利要求不具备创造性时，权利要求2、3、7-17、22-28、36、37也不具备创造性；（7）基于与评价权利要求1同样的理由，权利要求43、47、54、57、59、63不具有创造性；基于与评价权利要求2同样的理由，权利要求38、41、44、49、52、55、60不具备创造性；基于与评价权利要求5同样的理由，权利要求39、45、50、56、61不具有创造性；基于与评价权利要求18、29同样的理由，权利要求40、42、46、48、51、53、58、62、64不具有创造性；基于与评价权利要求4或6同样的理由，权利要求65-76相对于证据1、3、4的结合或相对于证据1、2、4的结合不具有创造性；（8）权利要求1涉及一种利用破囊壶菌目微生物生产含有多烯脂肪酸的脂质的方法。在生物分类学中，“目”是一个级别很高的分类单位，包含数量庞大的众多物种，这些物种之间在生理生化性质、代谢途径等方面可能具有相当大的差异。本发明实施例中仅实验了裂殖壶菌属的Schizochytrium菌株ATCC20888以及Schizochytrium野生型菌株。在仅仅测试了裂殖壶菌属的两个菌株的情况下，本领域技术人员不能预见到破囊壶菌目中数量庞大的其他微生物（包括破囊菌属）也可以实现发明目的，因此，权利要求1得不到说明书的支持，不符合专利法第26条第4款的规定，基于相同的理由，权利要求2-76也得不到说明书的支持。
经形式审查合格，专利复审委员会于2011年11月11日受理了上述无效宣告请求并将无效宣告请求书及证据副本转给了专利权人，同时成立合议组对本案进行审查。
专利权人针对上述无效宣告请求于2011年12月26日提交了意见陈述书，并认为：（1）权利要求1与证据1的区别之一在于证据1没有披露“向包含破囊壶菌目微生物的发酵培养基中添加非醇碳源和限制性营养源，添加的足以提高该发酵培养基的生物量密度到基于破囊壶菌目微生物细胞干重的至少100g/L”的特征，首先，证据4披露的是Cryptococcus curvatus的生物量密度高达118g/L，没有披露或教导权利要求1的特征“提高该发酵培养基的生物量密度到基于破囊壶菌目微生物的细胞干重的至少100g/L”；第二，根据证据5的教导，不能将证据4中称为Cryptococcus curvatus的微生物（属于酵母）培养至100g/L的方法简单转用到培养破囊壶菌目的微藻类的方法；第三，本专利方法中含有PUFA的脂质是在脂质生产阶段生成的，证据4中的PUFA不是在脂质生产阶段产生的；第四，证据1显示添加碳源或氮源不必然提高干细胞的量、脂质的量和DHA的产量，证据4教导随着生物量密度升高，PUFA降低，均没有给出向培养基添加碳源和氮源以提高生物量密度和多不饱和脂质的生产量的启示。因此，权利要求1相对于证据1和证据4的结合具备创造性，基于相同的理由，权利要求38、43、49、59、65、70也具备创造性；
（2）除与权利要求1具有创造性相同的理由以外，证据1和证据4都没有披露该“生产脂质的速度至少平均为0.5g/L/hr”的特征，因此，权利要求2－3、8－13、15－16、22－26、30－35、41、44、47、52、54、55、57、60、63、66、69、71、72、75具备创造性；证据1中没有给出降低发酵培养基中溶氧水平来提高脂质积累的启示，因此，权利要求27－28具备创造性；不能将证据5中使细菌、酵母和古细菌达到100－268g/L生物量密度的方法简单转用到将破囊壶菌目的微藻类培养到150g/L的方法，证据5也没有披露生产含有PUFA的脂质，因此，权利要求5、39、45、50、56、61具备创造性；证据1是在培养初期维持正常的氮源，但是在培养后期根据碳源的消耗量添加不足的部分，证据3是在指数期限制氮，两者完全相反，且证据3没有披露“提高该发酵培养基的生物量密度到基于破囊壶菌目微生物的细胞干重的至少100g/L”的特征，因此，权利要求4、18－20、40、46、51、62、65－69、71－75具备创造性；证据4记载的微生物不生产DHA，更没有披露DHA的产量和生产速率，因此，权利要求17、21、29、31、33、35、42、48、53、58、64、70、76具备创造性；证据1中没有教导如何分阶段改变供养及在不同阶段提供多少氧，证据2没有在发酵期间有意改变氧含量，没有披露或暗示脂质生成阶段期间的低氧水平，因此，权利要求6、18－20、65－69、71－75具备创造性；
（3）本专利的说明书提供了裂殖壶菌ATCC 20888的实施例。破囊壶菌目的微生物具有与本专利例示的裂殖壶菌ATCC 20888的微生物相似的性能，且根据证据2和证据3公开的内容，破囊壶菌目的微生物可用于生产含PUFA的脂质，因此，权利要求1－76符合专利法第26条第4款的规定。
专利复审委员会本案合议组于2012年2月14日将专利权人2011年12月26日提交的意见陈述书转送给请求人，并于2012年2月21日向双方当事人发出了口头审理通知书，定于2012年3月9日举行口头审理。
口头审理如期举行，双方当事人均委托代理人出席了本次口头审理。双方当事人对合议组成员无回避请求，对对方出庭人员的身份和资格无异议。在口头审理过程中，明确了如下事项：
（1）请求人表示其无效宣告请求的理由为权利要求1－3、8－17、22－28、30－35、38、41、43、44、47、49、52、54、55、57、59、60、63不具备创造性，依据的证据为证据1和证据4；权利要求4不具备创造性，依据的证据为证据1、证据3和证据4；权利要求6、7、36、37不具备创造性，依据的证据为证据1、证据2、证据4；权利要求5、39、45、56、61不具备创造性，依据的证据为证据1和证据4或证据1和证据5；权利要求18－21、29、40、42、46、48、50、51、53、58、62、64－76不具备创造性，依据的证据为证据1、证据3和证据4，或者证据1、证据2和证据4；权利要求1－76不符合专利法第26条第4款的规定，具体理由为，第一，破囊壶菌目范围过大，第二，涉及非醇碳源和限制性营养源的范围过宽，第三，多烯脂肪酸范围过宽。
合议组当庭宣布：非醇碳源和限制性营养源的范围过宽以及多烯脂肪酸范围过宽导致权利要求1－76得不到说明书支持是请求人在提出无效宣告请求之日起一个月后增加的无效宣告理由，因此根据专利法实施细则第66条的规定，合议组对此不予考虑；
（2）请求人当庭提交以下附件1－6用于说明本领域的公知常识，合议组将附件1－6的复印件当庭转送给专利权人：
附件1：Macrae，“Biotechnology in the Oils and Fats industry”，World Conference on Emerging Technologies in the Fats and Oils Industry，1986年，封面页、版权页、目录、第7－13页，复印件共10页，及其部分中文译文1页；
附件2：Ajay singh和Owen P.Ward，“Factor affecting microbial DHA production”，Advanced in applied biotechnology，1997年，封面页、版权页、目录、第294－304页，复印件共14页，及其部分中文译文3页；
附件3：《微生物学》，无锡轻工业学院、华南工学院、天津轻工业学院、大连轻工业学院合编，轻工业出版社，1985年9月第一版第四次印刷，封面页、版权页、目录、第153页，复印件共4页；
附件4：《菌物学概论》，C.W.明斯等著，中国农业出版社，2002年6月第4版第1次印刷，封面页、书名页、版权页、第650－656页，复印件共10页；
附件5：《Dictionary of the Fungi,8th Edition》，D.L.Hawksworth等，世界图书出版公司，封面页、书名页、版权页、第456、541、590页，复印件共6页，及其部分中文译文1页；
附件6：《Dictionary of the Fungi,9th Edition》，P.M.Kirk等，CABI Publishing，封面页、书名页、版权页、第521、569页，复印件共5页，及其部分中文译文1页；
（3）专利权人认可证据1－6、附件1－6的真实性，对证据1－5、附件1、2、4－6的译文准确性无异议，但认为附件1、2是会议资料，附件4不是教科书且出版日晚于本申请优先权日，附件5是外文字典，附件6的出版日在本专利申请日之后，因此，附件1、2、4－6都不是审查指南规定的公知常识性证据；请求人认为附件4记载的是本领域技术人员公知的对微生物的分类，其英文原文公开于本申请优先权日之前；
口头审理后，请求人于2012年3月23日提交了意见陈述书，坚持其在口头审理过程中陈述的意见。专利权人于2012年3月26日提交了意见陈述书，坚持其在口头审理过程中陈述的意见。
至此，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
（一）审查基础
本决定依据的审查基础是本专利的授权公告文本。
（二）证据认定
1、关于证据1－6
专利权人对证据1－6的真实性、公开性和关联性、证据1－5译文的准确性没有异议，合议组对证据1－6的真实性、公开性和关联性以及证据1－5译文的准确性亦予以认可。
2、关于附件1－6
附件1－6是请求人在口头审理过程中提交的证据，其中附件1为会议文集，附件2为科技文献，都不属于本领域的公知常识性证据，其提交时间超出了审查指南第四部分第三章第4.3.1节规定的请求人的举证期限，因此，合议组对附件1、2不予考虑。
附件4是中国农业出版社2002年6月出版的《菌物学概论》，附件6为2001年出版的《Dictionary of the Fungi,9th Edition》，请求人认为附件4、6记载的是本领域技术人员公知的对微生物的分类,并认为附件4的英文原文公开于本专利优先权日之前。对此，合议组认为：附件4、6虽然属于本领域的公知常识性证据，但其公开日均在本专利优先权日（2000年1月28日）之后，不能作为本专利的现有技术，因此，合议组对附件4、6不予考虑。
附件3是轻工业出版社出版的《微生物学》，附件5为世界图书出版公司出版的《Dictionary of the Fungi,8th Edition》，专利权人认可附件3为公知常识性证据，但认为附件5是外文字典，不是公知常识性证据。对此，合议组认为：附件3为微生物领域的教科书，附件5为微生物领域的技术词典，均属于所属技术领域的公知常识性证据，其提交时间并未超出审查指南第四部分第三章第4.3.1节规定的公知常识性证据的举证期限，因此，合议组对附件3、5予以考虑。专利权人对附件3、5的真实性、公开性和关联性、附件5的译文准确性没有异议，合议组对附件3、5的真实性、公开性和关联性以及附件5译文的准确性亦予以认可。
（三）无效宣告请求的理由和范围
本无效宣告请求案的审理范围为：权利要求1－3、8－17、22－28、30－35、38、41、43、44、47、49、52、54、55、57、59、60、63不具备创造性，依据的证据为证据1和证据4；权利要求4不具备创造性，依据的证据是证据1、证据3和证据4；权利要求6、7、36、37不具备创造性，依据的证据为证据1、证据2、证据4；权利要求5、39、45、56、61不具备创造性，依据的证据为证据1和证据4或证据1和证据5；权利要求18－21、29、40、42、46、48、50、51、53、58、62、64－76不具备创造性，依据的证据为证据1、证据3和证据4，或者证据1、证据2和证据4；权利要求1－76因破囊壶菌目或破囊壶属、Schizochytrium概括范围过宽而不符合专利法第26条第4款的规定。
（四）关于专利法第26条第4款
专利法第26条第4款规定：权利要求书应当以说明书为依据，说明要求专利保护的范围。
权利要求书应当以说明书为依据，是指权利要求书应当得到说明书的支持。权利要求书中的每一项权利要求所要求保护的技术方案应当是所属技术领域的技术人员能够从说明书充分公开的内容得到或者概括得出的技术方案，并且不得超出说明书公开的范围。
本专利权利要求1要求保护一种从破囊壶菌目微生物生产含有多烯脂肪酸的脂质的方法，所述微生物能产生占其产生的总脂质至少15％的多不饱和脂，该方法包括在含有非醇碳源和限制性营养源的发酵培养基中进行所述微生物的发酵；其中所述方法包括向包含所述微生物的发酵培养基中添加非醇碳源和限制性营养源，添加的速率足以提高该发酵培养基的生物量密度到基于细胞干重的至少100g/L；且其中所述具有基于细胞干重至少100g/L生物量密度的培养基发酵产生含有多烯脂肪酸的脂质。
为此，本专利说明书中实施例1检测了各种溶氧水平下Schizochytrium菌株ATCC20888的发酵结果，实施例2中验证了在ATCC20888的培养过程中，发酵培养基中低溶氧水平对最终生物量产物中DHA含量的影响，实施例3检测了ATCC20888生产DHA的补料分批发酵结果，实施例4、5分别检验了在低溶氧水平下14000加仑规模和41000加仑规模的Schizochytrium野生型菌株补料分批发酵的结果，实施例6检测了额外的氨对Schizochytrium野生型菌株发酵的影响，实施例7检测的1000加仑规模的Schizochytrium野生型菌株补料分批发酵的动力学特征，实施例8检测了碳源量对Schizochytrium野生型菌株发酵的影响，实施例9检测了营养限制对ATCC20888的生物量产量、转化效率、脂质含量和DHA含量的影响。
综上可见，本专利说明书中仅验证了利用Schizochytrium菌株ATCC20888和Schizochytrium野生型菌株实施本专利方法时的效果，而权利要求1则将方法中可采用的微生物概括至破囊壶菌目微生物。
如本领域技术人员所公知的，在微生物分类学中，种以上的系统分类单元自上而下依次可分七级，即：界、门、纲、目、科、属、种，每一个种中又包括大量不同的菌株。破囊壶菌目下同样包括了大量不同的菌种，不同菌种、甚至同一菌种的不同菌株之间均具有不同的特性。在本专利说明书中仅利用Schizochytrium菌株ATCC20888和Schizochytrium野生型菌株这两个具体菌株进行了实验，且缺乏充足的原理性说明的情况下，本领域技术人员根据说明书的描述并不能预见所有属于破囊壶菌目的微生物都可用于权利要求1的方法，并实现在至少100g/L的高密度培养过程中产生占总脂质至少15％的多不饱和脂，因此，权利要求1得不到说明书的支持，不符合专利法第26条第4款的规定。
专利权人认为：（1）破囊壶菌目的微生物具有与裂殖壶菌ATCC20888相似的性能，破囊壶菌目只涵盖一个科，虽然该科下面有几个属，但是所有成员都具有独特的特征，而且整个破囊壶菌目内保持着这种分类特征，这包括破囊壶菌目内各成员生产脂质的特征；（2）破囊壶菌目内的属的分类变化不能表明“破囊壶菌目微生物”覆盖范围过大；（3）根据证据1、2、3等现有技术公开的内容可知，本领域技术人员理解破囊壶菌目的微生物可用于生产含多不饱和脂肪酸的脂质，其中证据3中的UX株不属于破囊壶菌科的微生物，不能证明不是所有的破囊壶菌目的微生物都产生含有多不饱和脂肪酸的脂质。
对此，合议组认为：（1）破囊壶菌目下虽然只有一个科，但是该科下有多个属，每个属下又包含多个种，每个种中还含有大量不同的菌株，即权利要求1中的“破囊壶菌目微生物”实际上涵盖了数量庞大的微生物菌株，虽然这些菌株因相互之间的某些共性而被分类到同一个“目”下，但是这些菌株同样也具有大量不同的特性，而且微生物的分类主要是依据菌株之间的表型特征和亲缘关系，而不是依据其在脂质产生阶段生产含多不饱和脂肪酸的脂质的能力，更不会依据其在高生物量培养条件下积累多不饱和脂肪酸的能力。因此，本领域技术人员并不能预见所有破囊壶菌目微生物在生产含多不饱和脂肪酸的脂质方面都具有与裂殖壶菌ATCC20888相似的性能；（2）现有技术中筛选得到的能够用于生产多不饱和脂肪酸的菌株，相互之间的产脂性能也有所不同（例如证据2、3中ATCC20888、ATCC20889、ATCC28211、ATCC34304、ATCC28210、ATCC34473、ATCC28209同属于破囊壶菌目微生物，但其产脂性能差异明显），并且现有技术中均未涉及在高达100g/L的生物量密度下进行发酵的情况，而如本专利说明书第1页背景技术中所述的“当以极高细胞密度培养生产脂质的真核微生物时，它们的脂质通常都只含有极少量的多烯脂肪酸”，因此，在说明书中仅使用了特定菌株予以验证的情况下，本领域技术人员根据现有技术难以预见所有破囊壶菌目微生物都能够实现在至少100g/L的高密度培养过程中产生占总脂质至少15％的多不饱和脂。综上，专利权人的意见不具说服力。
权利要求2－25、27－40、42－46、48－51、53－56、58－62、64－68、70－74、76中未对“破囊壶菌目微生物”进行限定，基于相同的理由，上述权利要求也得不到说明书的支持，不符合专利法第26条第4款的规定。
权利要求26中进一步将所述微生物限定为选自破囊壶菌属、Schizochytrium及其混合物，然而破囊壶菌属和Schizochytrium仍然包含有多个种，每个种下又含有大量不同的菌株，虽然本专利说明书实施例中验证了利用Schizochytrium菌株ATCC20888和Schizochytrium野生型菌株实施本专利方法时的效果，但是是否所有破囊壶菌属和Schizochytrium微生物都可以用于生产多烯脂肪酸，并且能够实现在至少100g/L的高密度培养过程中产生占总脂质至少15％的多不饱和脂，现有技术中没有记载，并且说明书中也缺乏充足的原理性说明和/或实验来证实。因此，在本专利说明书实施例仅使用了特定菌株予以验证的情况下，本领域技术人员根据说明书的描述不能预见所有破囊壶菌属和Schizochytrium微生物都能够实现在至少100g/L的高密度培养过程中产生占总脂质至少15％的多不饱和脂，因此，权利要求26得不到说明书的支持，不符合专利法第26条第4款的规定。基于同样的理由，权利要求41、47、52、57、63、69、75也得不到说明书的支持，不符合专利法第26条第4款的规定。
综上所述，鉴于本专利权利要求1－76均不符合专利法第26条第4款的规定，本专利应被无效，故对于请求人在本无效宣告请求案中提出的其它无效理由，本案合议组不再予以评述。
基于以上事实和理由，本案合议组作出如下审查决定。
三、决定
宣告01806451.5号发明专利权无效。
当事人对本决定不服的，可以根据专利法第46条第2款的规定，自收到本决定之日起三个月内向北京市第一中级人民法院起诉。根据该款的规定，一方当事人起诉后，另一方当事人作为第三人参加诉讼。
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