发明创造名称：基于Taqman-ARMS技术检测基因突变分型的方法和试剂盒
外观设计名称：
决定号：41065
决定日：2019-07-05
委内编号：4W108546
优先权日：
申请（专利）号：201210291849.X
申请日：2012-08-16
复审请求人：
无效请求人：EPI基因组股份公司
授权公告日：2014-12-17
审定公告日：
专利权人：江苏为真生物医药技术股份有限公司
主审员：杨莹跃
合议组组长：尹昕
参审员：韩世炜
国际分类号：C12Q1/68
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点：发明与最接近的现有技术相比存在区别技术特征时，如果现有技术中并未给出将该区别技术特征应用于该最接近的现有技术的技术启示，则不应认为发明不具备创造性。
全文：
本专利的专利号为201210291849.X，申请日为2012年08月16日，授权公告日为2014年12月17日。本专利授权公告时的权利要求书如下：
“1. 基于Taqman-ARMS技术检测基因突变分型使用的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括检测目的基因的突变位点的ARMS引物和Taqman-MGB探针，所述ARMS引物的上游引物或下游引物的3’末端为突变位点，并将位于突变位点上游第1位核苷酸错义突变；
所述Taqman-MGB探针为特异识别ARMS引物的扩增产物正义链突变位点的Taqman探针，所述探针的3’端结合有小沟结合分子；
所述ARMS引物为SEQ ID No：3和SEQ ID No：5所示的核苷酸序列；
所述Taqman-MGB探针的核苷酸序列如SEQ ID No：9所示。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由PCR 缓冲液、dNTPs、引物对、Taqman-MGB探针、MgCl2、TaqDNA聚合酶和模板DNA组成，各组分反应时终浓度为：
PCR缓冲液 终浓度0.5～2.5×；
dNTPs 0.1～0.75mM；
引物对 上、下游引物终浓度分别为150～350nM；
模板DNA 0.01～10ng/μL；
TaqDNA聚合酶 0.01～1.0U/μL；
MgCl2 终浓度为1.5～3.5mM；
Taqman-MGB探针 终浓度为50～200nM。
3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述PCR 缓冲液、dNTPs、引物对、Taqman-MGB探针、MgCl2、TaqDNA聚合酶和模板DNA终浓度组成为：
PCR缓冲液 终浓度1×；
dNTPs 0.25mM；
引物对 上、下游引物终浓度分别为250nM；
模板DNA 0.05～1.5ng/μL；
TaqDNA聚合酶 0.01～1.0U/μL；
MgCl2 终浓度为2.0～2.5mM；
Taqman-MGB探针 终浓度为50nM。”
针对上述专利权，无效宣告请求人EPI基因股份公司（下称请求人）于2019年02月28日向国家知识产权局提出了无效宣告请求，同时提交了本专利的授权公告文本和7份证据，认为本专利权利要求1-3不符合专利法第22条第3款的规定，请求宣告本专利全部无效。请求人提交的7份证据如下：
证据1：公开号为CN102220413A的中国发明专利申请公开文本，公开日为2011年10月19日；
证据2：董强刚 等，“上皮生长因子受体外显子21基因突变L858R的实时定量PCR检测”，《肿瘤》，第27卷第2期，第150-154页，2007年2月，复印件共5页；
证据3：C. R. Newton等，Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS)，第17卷，第7期，第2503-2516页，1989，英文复印件共14页；
证据4：公开号为CN1769489A的中国发明专利申请公开文本，公开日为2006年05月10日；
证据5：王柯 等，“PCR-CTPP：一种基于错配技术的SNP分型方法的改良”，《遗传》，2011年；
证据6：Yi Liu等，A comparison of ARMS and direct sequencing for EGFR mutation analysis and Tyrosine Kinase Inhibitors treatment prediction in body fluid samples of Non-Small-Cell Lung Cancer patients，Journal of Experimental & Clinical Cancer Research，2011,30:111，英文复印件共8页；
证据7：公开号为CN101921830A的中国发明专利申请公开文本，公开日为2010年12月22日；
请求人认为，本专利的权利要求1-3不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定：
权利要求1与证据1的区别技术特征在于：（1）上游引物中错配碱基引入的位点不同；（2）本专利扩增阻滞突变系统（ARMS）的上下游引物序列不同；（3）本专利使用的探针为识别突变位点区域的Taqman-MGB探针，其序列为SEQ ID NO：9。对于区别技术特征（1），证据1已经给出了在3’末端引入错配碱基的启示，且在3’末端第2个碱基处引入错配也属本领域公知常识。此外，证据3也给出了在引物的3’末端引入其他人为错配碱基的技术启示，证据4公开了引物序列3’端突变位点上游第1、2位或第1、2、3位为错配碱基，证据5也给出了在引物的3’末端引入错配碱基的技术启示。对于区别技术特征（2），本专利上游引物与证据1的上游引物相比仅在5’末端缺少一位碱基G，属于常规选择和简单调整，至于下游引物的设计，属于本领域技术人员基于引物设计原则即可获得的，且未产生预料不到的技术效果。对于区别技术特征（3），证据2公开了检测EGFR L858R的一对引物和2条Taqman-MGB探针，该探针即为反义探针且识别区域包含突变位点，即证据2给出了利用包含EGFR突变位点的检测探针检测EGFR外显子21基因突变L858R的技术启示。另外，本专利的探针相比证据2的探针仅在5’端少了两位碱基而3’端多了一位碱基A，截短或增加少数几个碱基属于常规选择。证据6公开了ARMS技术检测具有1%灵敏度，说明书中并未记载区别技术特征给本专利带来预料不到的技术效果。综上，权利要求1不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。权利要求2-3进一步限定了所述试剂盒的组成及各成分的浓度，证据7已经公开了PCR反应试剂盒体系及浓度，在此基础上调整反应体系的终浓度属于常规操作，因此在其引用的权利要求不具备创造性的基础上，权利要求2-3也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
经形式审查合格，国家知识产权局于2019年03月12日受理了上述无效宣告请求并将无效宣告请求书及证据副本转给了专利权人，同时成立合议组对本案进行审查。
请求人于2019年03月27日补充提交了意见陈述书、本专利的授权公告文本和7份证据，其中，相对于前次提交的文件补充了证据3和6的部分中文译文，并将其作为相应证据的一部分，另外还提交了证据5的不同期刊版本，但具体的内容相同。其余证据与前次提出的相应证据相同。
请求人在意见陈述中重申了其提出无效宣告请求时的理由。
本案合议组于2019年04月02日将上述文件转送给专利权人。
专利权人针对上述无效宣告请求于2019年04月26日提交了意见陈述书和修改后的权利要求书，所作修改在于：将权利要求1中的“突变位点上游第1位核苷酸错义突变”修改为“突变位点上游第2位核苷酸错义突变”，将“所述ARMS引物为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列”修改为“所述ARMS引物为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列”。
修改后的权利要求1为：
“1. 基于Taqman-ARMS技术检测基因突变分型使用的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括检测目的基因的突变位点的ARMS引物和Taqman-MGB探针，所述ARMS引物的上游引物或下游引物的3’末端为突变位点，并将位于突变位点上游第2位核苷酸错义突变；
所述Taqman-MGB探针为特异识别ARMS引物的扩增产物正义链突变位点的Taqman探针，所述探针的3’端结合有小沟结合分子；
所述ARMS引物为SEQ ID No：3和SEQ ID No：6所示的核苷酸序列；
所述Taqman-MGB探针的核苷酸序列如SEQ ID No：9所示。”
对于权利要求的修改，专利权人认为，根据本专利图1可知，扩增条带最亮且没有非特异扩增的是标号为3的条带，即突变位点上游第2位错义突变（参见说明书第0033段），即采用序列SEQ ID NO：6扩增的结果（参见说明书第0045段表1）。而且说明书第48段也明确记载了“因此，SEQ ID No：6所示的核昔酸序列为ARMS上游引物效果最佳，将SEQ ID No：6和SEQ ID No：3构成的引物对扩增效率最高，条带特异”，因此，本领域技术人员可以明显确定：说明书第48段中记载“引入错配碱基最佳位置在第1位”是明显笔误，而且实施例2至8中记载的“以SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：3的核昔酸序列为引物”也是明显的笔误，本领域技术人员很明显可以确定此处验证的都是最佳实施方案，即“以SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：3的核昔酸序列为引物”，因此，专利权人对权利要求的修改应当被允许。针对无效宣告请求的理由，专利权人认为：（1）本专利的技术方案是基于扩增阻滞突变系统（ARMS）引物检测突变和Taqman-MGB探针检测突变两种技术手段同时对基因突变位点进行检测的一种技术方案，这两种手段结合提高了检测的特异性，而且探针的设计并非本领域常规的可以任意针对正义链或反义链。证据1采用的是酶切富集PCR和ARMS荧光定量PCR方法的结合，需要2次PCR扩增，且其探针未覆盖突变位点，只是简单地指示荧光信号，其上游引物与本专利虽然仅相差1个碱基，但并不是本领域技术人员可预期的。证据2的探针虽然是反义探针且覆盖了突变位点，但与其配套的引物并非ARMS引物，只是常规的扩增引物，而且证据2设计了两条探针，其扩增体系会对野生型和突变型都进行扩增，而本专利仅针对突变序列，二者的技术构思在整体上不同，本领域技术人员不会有动机结合证据2的探针。（2）至于引物3’端引入错配碱基的位置，虽然在3’端附近再引入一个错配碱基是常规做法，但对于具体的位置是不容易预期的，在本专利中，上游第2个位置引入错配具有最佳的效果。现有技术中给出的也都是不同的引入位置启示，例如证据1记载的是在第4位碱基处引入，证据3笼统的记载了在3’端附近引入，证据4公开的则并非ARMS技术，且其公开的是倒数第2、3位或第2、3、4位碱基同时错配，且其检测对象与本专利完全不同，证据5公开的是四引物扩增受阻突变体系PCR，与本专利的不同，检测基因及相应的引物序列也不同于本专利，针对特定基因的特定突变位点，以及由于设计的引物序列长度等因素影响，在哪个位置引入具有最优效果是无法预期的。（3）对于检测灵敏度，证据6所记载ARMS的1%灵敏度只是理论上的灵敏度，本专利的技术是ARMS结合Taqman同时检测突变的技术方案，是否能达到与单独ARMS技术相同的灵敏度是本领域技术人员无法预期的。
本案合议组于2019年04月30日将专利权人提交的上述文件转送给请求人，并于2019年05月20日向双方当事人发出了口头审理通知书，定于 2019年07月05日举行口头审理。
请求人于2019年06月13日提交了意见陈述书，针对专利权人于2019年04月26日提交的权利要求修改，指出本专利说明书共涉及4组并列技术方案，而专利权人选择保护第二组，这种修改不属于针对授权权利要求的明显错误的修改，而属于技术方案的实质性变更；另外，本专利中所使用的探针序列是和SEQ ID NO：5所示的引物序列匹配。因此上述修改不符合专利法实施细则第69条的规定，同时坚持本专利权利要求1-3相对于证据1-7不具备创造性的理由。
合议组于2019年06月20日将请求人的上述文件转送给专利权人。
口头审理如期举行，双方当事人均委托代理人出席了本次口头审理。在口头审理过程中双方对合议组成员无回避请求，对对方当事人及其出庭人员的资格和身份无异议，并确定了如下事实：
（1）合议组当庭告知双方，专利权人对于权利要求的修改不符合审查指南的相关规定，不予接受，因此以授权公告时的文本作为口审调查的基础。
（2）请求人确认以2019年03月27日提交的证据1-7和无效请求意见书为准，并当庭提交了两份公知常识性证据（编号续前）：
证据8：卢圣栋 主编，《生物技术与疾病诊断-兼论人类基因治疗》，化学工业出版社，现代生物技术与医药科技出版中心，2002年2月，封面页、出版信息页、第36页，共3页；
证据9：吕建新、尹一兵，《分子诊断学 第2版》，中国医药科技出版社，2010年2月，封面页、出版信息页、第86-87页，共4页。
专利权人对证据1-9的真实性、公开性、合法性和关联性均无异议，对证据3和6的中文译文无异议。
（3）请求人指出证据3-5的使用方式相同，均是为了提供引物的3’端可引入人为错配突变的教导。证据8涉及突变等位基因特异PCR，即本专利的ARMS，用于证明该方法及在引物的倒数第二位引入人为的错配碱基是本领域公知常识；证据9涉及荧光探针法，用于证明Taqman技术是本领域的公知常识。
（4）请求人确认本专利不具备创造性的理由为：权利要求1相对于证据1、2和公知常识的组合，证据1、2和3（任选的还可以为证据4、5或6）与公知常识的组合，证据1、2、6和3（任选的还可以为证据4、5）以及公知常识的组合均不具备创造性。在权利要求1不具备创造性的基础上，权利要求2、3相对于上述组合形式再结合证据7均不具备创造性。
至此，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
1、审查基础
专利权人在无效宣告审查过程中提交了权利要求书的修改替换页，所作修改为：将权利要求1中的“突变位点上游第1位核苷酸错义突变”修改为“突变位点上游第2位核苷酸错义突变”，将“所述ARMS引物为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列”修改为“所述ARMS引物为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列”。
对于上述修改，合议组认为，首先，根据本专利说明书表1的记载，修改后的上游引物“SEQ IN NO：6”和修改前的“SEQ IN NO：5”均是本专利中所列举的并列技术方案，尽管扩增的效果上有所差异，但它们均能实现目的片段的扩增，另外，除了“SEQ IN NO：6”之外，上游引物“SEQ IN NO：7”同样能够特异性地扩增出目的条带，由此可见，“SEQ IN NO：6”作为上游引物可能是其最优选但并非唯一可选的实施方式。其次，根据本专利所采用的与扩增引物配合使用的探针序列（即SEQ ID NO：8和9）可知，上述序列与SEQ ID NO：5作为上游引物时扩增产物的序列是100%匹配，即上述探针序列应当是针对SEQ ID NO：5而设计的，而除上述探针序列之外，本专利再未给出其他的探针序列；再者，本专利附图1中SEQ ID NO：6作为上游引物所对应的条带3比其他条带更亮，而在说明书中多个实施例中均以SEQ ID NO：5作为上游引物，专利权人将二者的不一致解释为是说明书记载的笔误，然而，上述不一致也有可能是附图1中条带标记的笔误，在这种情况下SEQ ID NO：5作为上游引物将会成为最佳技术方案，可见，将“SEQ ID NO：5”修改为“SEQ ID NO：6”并非唯一合理的修改方向。综上可知，“错配碱基最佳位置在第1位”，引物为“SEQ ID NO：5”并不属于明显笔误，专利权人对权利要求书的上述修改增加了未包含在授权权利要求中的技术特征，由此改变了权利要求的保护范围，不符合审查指南的相关规定，上述修改不予接受。因此，本无效宣告请求审查决定仍以本专利授权公告时的文本为审查基础。
2、证据认定
专利权人对证据1-7以及请求人当庭提交的公知常识性证据8、9的真实性、合法性和关联性均无异议，对证据3和6的相关中文译文无异议，对此合议组予以确认。证据1-9的公开日期均在本专利申请日之前，可以作为现有技术评价本专利的创造性。
3、关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
发明与最接近的现有技术相比存在区别技术特征时，如果现有技术中并未给出将该区别技术特征应用于该最接近的现有技术的技术启示，则不应认为发明不具备创造性。
本专利权利要求1请求保护一种基于Taqman-ARMS技术检测基因突变分型使用的试剂盒，其中限定了ARMS引物和Taqman-MGB探针的具体序列。根据本专利说明书的记载，Taqman探针是在Real-time PCR技术平台发展出的荧光检测技术，探针的5’端含有荧光报告基团，3’端含有荧光淬灭基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，当进行PCR扩增时，Taq DNA聚合酶的5’端到3’端的外切酶活性将探针酶切降解，使得报告基团和淬灭基团分离，发出荧光信号，从而达到荧光信号的积累与PCR产物形成完全同步。而扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system，ARMS）是基于PCR技术基础上发展起来的用于检测点突变或多态性的技术。其PCR扩增时使用缺乏3’端到5’端外切酶活性的Taq DNA 聚合酶，因此不能修正引物3’端碱基错配，只要引物3’端与模板1个碱基不配对，便无法扩增出特异性产物。本发明采用了联合使用Taqman和ARMS技术检测基因突变分型的方法，其设计的ARMS引物针对基因突变序列，能特异性扩增突变模板DNA，同时本发明的Taqman-MGB探针针对目的基因正义链的突变位点设计，特异地结合突变模板DNA（参见本专利说明书第0029-0032段）。由此可见，虽然覆盖突变位点的ARMS引物检测和Taqman-MGB探针分别可以实现对基因突变位点的检测，但本专利权利要求1的技术方案将两者组合起来，可以同时对EGFR的基因突变位点L858R进行检测。根据说明书的记载，这种组合有助于提升检测的特异性及灵敏性（参见说明书第0032段）。
请求人提交了证据1作为最接近的现有技术，其中公开了一种检测表皮生长因子受体（EGFR）基因外显子19缺失突变E746_A750del和外显子21点突变L858R的试剂盒，包括：酶切富集PCR体系，ARMS荧光定量PCR体系，所述ARMS荧光定量PCR体系包括Taqman探针和ARMS引物，其中，所述的ARMS引物为：
L858R上游引物：5’-GTCAAGATCACAGATTTTGCGCG-3’
L858R下游引物：5’-GGAAAATGCTGGCTGACCTAAAG-3’
所述的Taqman探针序列为：
L858R探针：5’-FAM-TTCTTTCTCTTCCGCACCCAGCAGT-TAMR-3’
其中，所述ARMS引物的3’末端位于目的突变位点区并与突变型相匹配，且在ARMS引物的3’末端第4个碱基处再引入一个错配碱基（即对应于突变位点的上游第3位核苷酸，参见证据1权利要求8，说明书第35-50段）。经序列比对可知，L858R探针特异性识别ARMS引物扩增产物的正义链，但未覆盖突变位点。
由此可见，权利要求1与证据1相比的区别技术特征在于：（1）上下游引物的核苷酸序列不同；（2）上游引物中错配碱基引入的位点不同；（3）本专利的Taqman探针识别包含突变位点区域的反义链，其覆盖了突变位点，而证据1采用的Taqman探针识别突变位点之外区域的正义链。基于上述区别技术特征，本专利权利要求1实际要解决的技术问题是提供另外一种具有较高特异性和灵敏度的针对EGFR基因L858R突变位点的检测方法。
对于上述区别技术特征（3），首先，证据1设计的Taqman探针的结合位点位于靶标序列突变位点的下游，并未覆盖或包含上述突变位点，即上述探针仅仅提供了荧光信号，并不能特异性对上述突变位点进行区分。由此可见，尽管证据1公开了采用ARMS引物和Taqman探针的组合对EGFR基因的L858R突变位点进行检测，同时Taqman探针的设计也是本领域的常规技能，但证据1的上述内容表明了选择ARMS引物时无需配合特异性针对突变位点的探针也能够实现对上述突变位点的分型，同时证据1中还采用了酶切富集PCR的技术手段来提升检测的特异性和灵敏度，本领域技术人员在对比文件1的基础上，没有动机考虑将覆盖突变位点的Taqman探针与ARMS引物组合使用。
其次，证据2涉及上皮生长因子受体外显子21基因突变L858R的实时定量PCR检测，具体公开了在进行PCR扩增时所使用的引物对，并根据Taqman MGB原理设计了针对野生型和突变型的特异性探针（参见证据2摘要，第151页右栏）。根据相关核苷酸序列，证据2中与上述特异性探针配合使用的引物是位于上述突变位点上下游的普通扩增引物，并非ARMS引物，由此可见，证据2的上述内容表明了单独采用特异性针对突变位点的Taqman探针配合普通扩增引物即能够实现基因突变位点的分型，但并未公开或教导特异性针对突变位点的Taqman探针可以或需要与ARMS引物组合使用。因此，虽然证据2公开了利用包含EGFR突变位点的检测探针检测EGFR外显子21基因突变L858R，其探针序列也与本专利较为接近，由于其并未教导将上述探针与ARMS引物组合使用，本领域技术人员也没有动机将该探针应用到证据1的技术方案中。
此外，证据3涉及在ARMS扩增时在引物的3’末端引入其他人为错配碱基；证据4涉及PCR阻断联合荧光探针检测基因突变，其中未记载采用特异性针对突变位点的探针；证据5涉及两对交叉引物PCR技术（PCR-CTPP），证据6涉及利用ARMS对非小细胞肺癌患者EGFR的突变分析；证据8涉及突变等位基因特异性PCR，并未涉及Taqman探针，证据9涉及荧光探针法的检测原理，可见，证据3-6、8和9均未给出将ARMS引物与特异性针对突变位点的Taqman探针组合使用的教导。
对于本专利的技术效果，根据本专利说明书实施例8的验证，本专利的检测体系检测成功率达100%，阳性检出率为100%，与测序方法相比的检测一致率为95%，即本专利的技术方案具备较高的特异性和灵敏度，取得了有益效果。
综上所述，本领域技术人员依据现有证据无法显而易见地获得本专利的技术方案，权利要求1相对于证据1、证据2和公知常识的结合、相对于证据1、2与证据3-6和公知常识的任意组合也都具备创造性，请求人关于权利要求1不符合专利法第22条第3款规定的无效理由均不成立。
权利要求2和3均直接或间接引用了独立权利要求1，证据7涉及利用高分辨率熔解曲线检测EGFR基因的多个突变位点，其中未涉及使用探针，更未给出将ARMS引物与特异性针对突变位点的Taqman探针组合使用的教导，在权利要求1具备创造性的基础上，请求人关于权利要求2、3不符合专利法第22条第3款规定的无效理由也不成立。
请求人认为，ARMS技术是本领域的公知常识，而针对突变位点设计覆盖该位点的Taqman检测探针是本领域的常规技术手段。证据1教导了ARMS与Taqman探针的结合，证据2给出了利用覆盖EGFR突变位点的检测探针检测EGFR外显子21基因突变L858R的技术启示。将两者结合使用对本领域技术人员是显而易见的。
对此，合议组认为，尽管ARMS技术和利用覆盖突变位点的探针的Taqman检测技术都是本领域技术人员已知的检测基因突变的技术，但这并不意味着将两者组合使用就是显而易见的，需要由本领域技术人员综合考虑两者组合的必要性、难度及其组合的效果。首先，如前所述，证据1虽然将ARMS引物与Taqman探针组合使用，但其公开的Taqman探针没有针对靶标序列的突变位点进行设计。从现有技术公开的信息中可以看出，没有将ARMS引物与Taqman探针都针对靶标序列的突变位点进行设计的必要；其次，两者组合后在扩增过程中会同时针对突变序列进行检测，因此在同等条件下对提升特异性和灵敏性会具备一定优势。综上所述，在现有技术没有公开或者暗示可以采取将针对突变位点设计的Taqman探针和ARMS引物组合使用来检测EGFR基因L858R突变的情况下，本领域技术人员没有动机进行这种改进。因此，请求人的理由不能成立。
基于上述事实和理由，合议组作出如下决定。
三、决定
维持第201210291849.X号发明专利权有效。
当事人对本决定不服的，可以根据专利法第46条第2款的规定，自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。根据该款的规定，一方当事人起诉后，另一方当事人作为第三人参加诉讼。
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