发明创造名称：分析细胞增殖性病症的方法和核酸
外观设计名称：
决定号：40815
决定日：2019-07-10
委内编号：4W108188
优先权日：
申请（专利）号：201410147754.X
申请日：2006-04-17
复审请求人：
无效请求人：江苏为真生物医药技术股份有限公司
授权公告日：2017-07-28
审定公告日：
专利权人：EPI基因组股份公司
主审员：曹克浩
合议组组长：邹凯
参审员：杨莹跃
国际分类号：C12Q1/68，C12N15/11，G01N33/574
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款，第26条第3款、第4款
决定要点：如果本领域技术人员根据说明书的记载，结合所掌握的普通技术知识，能够实施权利要求所保护的技术方案并能合理预期其可以实现预期的技术效果，即使说明书中存在其他缺陷，也不会导致说明书未充分公开所保护的技术方案。
全文：
本无效宣告请求涉及专利号为ZL201410147754.X，申请日为2006年04月17日，授权公告日为2017年07月28日的发明专利（下称本专利）。
本专利授权公告时的权利要求书如下：
“1. 用于确定Septin 9基因或基因组的Septin 9序列的甲基化水平的装置在制备用于检测和/或分类个体中癌症的方法的试剂盒中的用途，
其中所述方法包括确定分离自所述个体的生物样品中Septin 9基因或基因组的Septin 9序列的甲基化水平，其中CpG甲基化表明所述癌症存在或其种类。
2. 如权利要求1所述的用途，其中CpG甲基化的存在表明癌性细胞增殖性病症的存在，而其不存在表明良性细胞增殖性病症的存在，其中所述癌性细胞增殖性病症区别于所述良性细胞增殖性病症。
3. 如权利要求1所述的用途，其中所述癌症为肝细胞癌或结肠直肠癌。
4. 如权利要求1所述的用途，其中所述甲基化水平通过检测所述Septin 9基因或基因组的Septin 9序列内CpG甲基化的存在与否来确定，其中甲基化的存在表明癌性细胞增殖性病症的存在。
5. 如权利要求1所述的用途，其中从所述个体获得的所述生物样品选自细胞系、组织学切片、组织活检、石蜡包埋的组织、体液、粪便，及其组合。
6. 如权利要求1所述的用途，其中从所述个体获得的所述生物样品选自结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液中分离的细胞，及其组合。
7. 区分基因组DNA至少一个靶区域内甲基化和未甲基化CpG二核苷酸的至少一种试剂或成组试剂在制备用于检测和/或分类个体中癌症的方法的试剂盒中的用途，其中所述方法包括使从所述个体生物样品中分离的基因组DNA与所述至少一种试剂或成组试剂接触，
其中所述靶区域等同于或互补于至少一种分别选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3的序列的至少16连续核苷酸的序列，其中所述连续核苷酸包含至少一个CpG二核苷酸序列，由此至少部分地提供对癌症的检测和/或分类。
8. 将5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或在杂交性能方面可检测地不同于胞嘧啶的其它碱基的一种或多种试剂，和
扩增酶和至少一种包含至少9核苷酸连续序列的引物
在制备用于检测和/或分类个体中癌症的方法的试剂盒中的用途，其中所述方法包括：
a)提取或以其它方式从所述个体生物样品分离基因组DNA；
b)用所述一种或多种试剂处理a)的所述基因组DNA或其片段；
c)使所述经处理的基因组DNA或其经处理的片段与所述扩增酶和所述至少一种引物接触，所述引物包括至少9核苷酸的连续序列，其等同于或互补于选自SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：15及其互补序列的序列，其中所述经处理的基因组DNA或其片段被扩增以产生至少一种扩增产物或不被扩增；以及
d)基于所述扩增物是否存在或其性质，确定选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3的序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平，或者反映选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3的序列的多个CpG二核苷酸平均甲基化状态或水平的均值或值，由此至少部分地提供至少检测和分类癌症之一。
9. 如权利要求8所述的用途，其中b)中处理所述基因组DNA或其片段包括使用选自亚硫酸氢盐、酸式亚硫酸盐、焦亚硫酸盐及其组合的试剂。
10. 如权利要求8所述的用途，其中c)中的接触或扩增包括使用至少一种选自如下的方法：使用耐热DNA聚合酶作为所述扩增酶；使用缺乏5’-3’外切酶活性的聚合酶；使用聚合酶链式反应(PCR)；产生带有可检测标记的扩增产物核酸分子。
11. 如权利要求7所述的用途，其中从所述个体获得的所述生物样品选自细胞系、组织学切片、组织活检、石蜡包埋的组织、体液、粪便，及其组合。
12. 如权利要求7所述的用途，其中从所述个体获得的所述生物样品选自结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液中分离的细胞，及其组合。
13. 如权利要求8所述的用途，其中所述方法还在步骤d)中包括使用至少一种核酸分子或肽核酸分子，其在各种情况下都包含等同于或互补于选自SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：15序列及其互补序列的至少9核苷酸长度的连续序列，其中所述核酸分子或肽核酸分子抑制其所杂交的所述核酸的扩增。
14. 如权利要求8所述的用途，其中d)中的确定包括至少一种核酸分子或肽核酸分子的杂交，所述至少一种核酸分子或肽核酸分子在各种情况下包含等同于或互补于选自SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：15序列及其互补序列的至少9核苷酸长度的连续序列。
15. 如权利要求14所述的用途，其中所述至少一种杂交的核酸分子或肽核酸分子被连接到固相。
16. 如权利要求14所述的用途，其中所述方法还包括使所述至少一种杂交的核酸分子延伸至少一个碱基。
17. 如权利要求8所述的用途，其中d)中的确定包括对所述扩增产物的测序。
18. 如权利要求8所述的用途，其中c)中的接触或扩增包括使用甲基化特异的引物。
19. 如权利要求8所述的用途，其中从所述个体获得的所述生物样品选自细胞系、组织学切片、组织活检、石蜡包埋的组织、体液、粪便，及其组合。
20. 如权利要求8所述的用途，其中从所述个体获得的所述生物样品选自结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液中分离的细胞，及其组合。
21. 一种或多种甲基化敏感限制酶和
扩增酶和适于扩增具有选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3的序列的至少一个CpG二核苷酸的至少两种引物
在制备用于检测和/或分类癌症的方法的试剂盒中的用途，其中所述方法包括：
a)提取或以其它方式从得自所述个体的生物样品分离基因组DNA；
b)以一种或多种甲基化敏感限制酶消化a)的所述基因组DNA或其片段；
使b)的DNA限制酶消化产物与所述扩增酶和所述至少两种引物接触；以及
c)基于扩增产物存在与否，确定选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3的序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平，由此至少部分 地提供至少检测和分类癌症之一。
22. 如权利要求21所述的用途，其中通过杂交至少一种核酸或肽核酸来确定扩增产物的存在与否，所述至少一种核酸或肽核酸等同于或互补于选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3的序列的至少16碱基长片段。
23. 衍生自基因组SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3的经处理的核酸在制备用于检测和/或分类癌症的试剂盒中的用途，其中所述处理适合于将所述基因组DNA序列的至少一个未甲基化的胞嘧啶碱基转化至尿嘧啶或在杂交上可检测地不同于胞嘧啶的其它碱基。
24. 核酸在制备用于检测和/或分类癌症的试剂盒中的用途，所述核酸为选自SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：15的经处理的基因组DNA序列及其互补序列的至少16连续核苷酸，其中所述处理合适于将所述基因组DNA序列的至少一个未甲基化的胞嘧啶碱基转变为尿嘧啶或在杂交上可检测地不同于胞嘧啶的其它碱基。
25. 核酸在制备用于检测和/或分类癌症的试剂盒中的用途，所述核酸为选自SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：15的经处理的基因组DNA序列及其互补序列的至少50连续核苷酸，其中所述处理合适于将所述基因组DNA序列的至少一个未甲基化的胞嘧啶碱基转变为尿嘧啶或在杂交上可检测地不同于胞嘧啶的其它碱基。
26. 适合于权利要求7之用途的试剂盒，包括(a)亚硫酸氢盐试剂；(b)适合于容纳所述亚硫酸氢盐和患者生物样品的容器；(c)含有两种寡核苷酸的至少一套寡核苷酸，其序列在各种情况下都等同于或互补于选自SEQID NO：4至SEQ ID NO：15的序列的9碱基长片段。
27. 如权利要求26所述的试剂盒，其中所述序列在各种情况下都等同于或互补于选自SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：15的序列的18碱基长片段。
28. 适合于权利要求7之用途的试剂盒，包括(a)甲基化敏感限制酶试剂；(b)适合于容纳所述试剂和患者生物样品的容器；(c)含有一种或多种核酸或肽核酸的至少一套寡核苷酸，其等同于或互补于选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3的序列的至少9碱基长片段；以及任选地，(d)使用和解释试剂盒结果的说明书。
29. 权利要求26-28中任一项所述的试剂盒在制备用于癌症的诊断和/或分类的试剂盒中的用途。”
针对该专利权，无效宣告请求人江苏为真生物医药技术股份有限公司（下称请求人）于2018年11月30日向国家知识产权局提出了无效宣告请求，同时提交了如下证据：
证据1：CpG island methylator phenotype in cancer, Jean-Pierre Issa, www.nature.com/reviews/cancer, 公开日：2004年12月，以及相关部分中文译文；
证据2：专利号为US6783933B1的美国专利，公开日2004年08月31日，以及其相关部分中文译文；
证据3：“DNA methylation: approaches, methods and applications”，Manel Esteller编著, CRC Press，公开日：2004年9月29日，以及相关部分中文译文；
证据4：Martha M. Pao等, The endothelin receptor B (EDNRB) promoter displays heterogeneous, site specific methylation patterns in normal and tumor cells, Human Molecular Genetics, 2001, 第10卷, 第9期, 903-910页，公开日：2001年12月31日，以及相关部分中文译文；
证据5：W. Jeffrey Allard等，Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant Diseases, Clinical Cancer Research, 第10卷, 6897–6904, 公开日：2004年10月15日，以及相关部分中文译文；
证据6：本专利母案（中国专利申请CN200680012490）的公开文本；
证据7：Jane L. Boddy等，Prospective Study of Quantitation of Plasma DNA Levels in the Diagnosis of Malignant versus Benign Prostate Disease，Clinical Cancer Research, 第11卷, 1394–1399, 公开日：2005年02月15日，以及相关部分中文译文；
证据8：Yulia Korshunova等, Massively parallel bisulphite pyrosequencing reveals the molecular complexity of breast cancer-associated cytosine-methylation patterns obtained from tissue and serum DNA, Genome Res. 2008 18: 19-29，公开日：2007年11月21日，以及相关部分中文译文；
证据9：Frank Diehl等，Detection and quantification of mutations in the plasma of patients with colorectal tumors， 16368–16373，PNAS，第102卷，第45期，公开日：2005年11月08日，以及相关部分中文译文。
以及，
附件1：从NCBI中获取的SEPT9基因各个转录本的信息、本专利序列3的具体序列及其检测区域信息，共3页；
附件2：本专利说明书图3-4的清楚版示意图，共2页。
请求人于2018年12月29日提交了补充意见书及以下证据（编号续前）：
证据10: Altered expression of the septin gene, SEPT9,in ovarian neoplasia, James F Burrows等, Journal of Pathology, 201:581-588，2003年公开，以及其全文中文译文；
证据11：公开号为CN1539023A的中国专利申请公开文本，公开日：2004年10月20日；
证据12：DNA Methylation Markers in Patients with Gastrointestinal Cancers, Catherine Lofton-Day和Ralf Lesche, 2003 S. Karger AG, Basel, 公开日：2003年，以及其全文中文译文；
证据13：The pathobiology of the septin gene family, Peter A Hall和SE Hilary Russell, Journal of Pathology; 204: 489-505，2004年公开，以及相关部分中文译文；
证据14： Integrated genomic and epigenomic analyses pinpoint biallelic gene inactivation in tumors, Giuseppe Zardo等人，nature genetics，第32卷，公开日：2002年11月，453-458页，以及其相关部分中文译文；
证据15：DNA Methylation Protocols, Edited by Ken I. Mills, PhD and Bernard H. Ramsahoye, ? 2002 Humana Press Inc.999 Riverview Drive, Suite 208 Totowa, New Jersey 07512，公开日：2002年，以及相关部分中文译文；
证据16：公开号为WO03/045230A2的国际申请公开文本，公开日：2003年06月05日，以及相关部分中文译文；
证据17：申请号为US60/672,242的美国专利申请优先权文件，及全文中文译文；
证据18：申请号为US60/676,997的美国专利申请优先权文件，及全文中文译文；
证据19：申请号为US60/697,521的美国专利申请优先权文件，及全文中文译文；
证据20：申请号为US60/704,860的美国专利申请优先权文件，及全文中文译文；
证据21：申请号为US60/709,318的美国专利申请优先权文件，及全文中文译文；
证据22：申请号为US60/723,602的美国专利申请优先权文件，及全文中文译文；
证据23：申请号为US60/787,402的美国专利申请优先权文件，及全文中文译文；
证据24：公开号为WO2006/008128A2的国际申请公开文本，公开日：2006年01月26日，及相关部分中文译文；
证据25：专利号为US6783933B1的美国专利，公开日：2004年08月31日，以及相关部分中文译文；以及，
附件3：本专利SEQ ID NO:3、9、14、15与证据24的SEQ ID NO:13、518、753、754的序列比对，共19页。
请求人在两次无效意见书中认为：
（一）本专利说明书公开不充分，不符合专利法第26条第3款的规定：
1、本专利权利要求1-29中的CpG“甲基化”和“甲基化状态或水平”是指在Septin 9基因或基因组的序列（或SEQ ID NO:1-3）中任何一个CpG或多个CpG位置上存在甲基化的任何情况。然而，证据1表明CpG位点甲基化广泛存在于正常细胞中，在个体基因组中存在至少一个或多个的CpG位点甲基化（即甲基化状态或水平），而且从本专利说明书中可以看出在健康个体中该序列上也存在CpG位点甲基化。因此，仅仅依据Septin 9基因组或基因（SEQ ID NO:1-3）中的甲基化并不能将癌症与健康状况或其他疾病状况区分开，更不能将不同种类的癌症区分开，即本领域技术人员采用该技术手段不能解决所要解决的技术问题；
2、证据2-3表明癌症中的具体CpG的异常甲基化通常与其所处区域有关。不同CpG岛，乃至同一CpG岛上，不同CpG位置的甲基化水平以及其与疾病的关系都有差异，然而，结合附件1可以看出，本专利说明书仅仅公开了在SEQ ID NO: 1中特定130bp的区域中的CpG甲基化状态的试验数据（实施例2-4），没有公开130bp区域之外的其他区域（例如SEQ ID NO:2的序列区域）的试验数据，而SEQ IN NO:1-3的区域分别长达20万bp以上、1405bp和2365bp，因此，不能证明其他靶区域也能实现预期效果。
3、本专利未提供过在匹配样品或群体之间Septin9甲基化状态的比较，而证据4表明使用全血作为样品检测的结果反映的不是癌组织细胞的DNA的状况，证据5显示癌症中出现的DNA甲基化的差异，不仅反映在不同的CpG位置上，也反映在不同组织样品，不同癌症患者甚至是同一癌症个体的相同肿瘤的不同区域中，因此，基于非匹配样品（结直肠癌组织样品和正常患者全血样品）在特定基因区域的上述实验数据，无法证明Septin 9甲基化标志物与癌症之间必然存在关联。
4、说明书实施例3（即说明书第0584段）中涉及“NAT/非临近结肠组织”的技术手段无法实施，说明书实施例4中的样品设计不合理，并且实施例4的结果无法区分癌症个体和非癌症个体（参见附件2）。
（二）本专利权利要求1-29得不到说明书的支持，不符合专利法第26条第4款的规定：
1、基于与前述有关本专利说明书公开不充分的理由，本领域技术人员无法确信本专利权利要求1-29中限定的任何一个CpG甲基化（例如特定130bp的区域之外的CpG甲基化）均能够实现技术目的，因此权利要求1-19得不到说明书的支持；
2、权利要求1-2、4-29涉及特征“癌症”、权利要求3涉及特征“肝癌或结肠直肠癌”、权利要求2涉及特征“良性细胞增殖性病症”，而本专利说明书实施例2-3仅涉及结直肠癌和乳腺癌，实施例4仅涉及几种特定癌症，且实验数据不能证明甲基化与这几种特定癌症之间存在关联；说明书也未提供对来源于良性细胞增殖性疾病的样品中甲基化水平的检测，因此，上述权利要求概括的保护范围得不到说明书的支持；
3、本专利说明书实施例仅仅公开了利用结直肠癌组织样品对癌症中的Septin 9的甲基化状态进行了检测，而证据7表明样品的类型（即使是同样来源于血液的血清或血浆），甚至是对同一类的样品的不同处理过程（单离心血浆还是双离心血浆）都会影响最终的检测结果；证据8表明癌症患者和健康个人的全血甲基化水平没有差异；证据9佐证证据5中说明肿瘤细胞DNA在全血中的含量极其微量。此外，证据1也指出，正常个体中DNA甲基化可以因包括年龄、环境和慢性炎症等无关因素而升高（第992页左栏第2段第4-13行和中间栏第1段第10-18行）。这都将可能导致无症状正常个体的尿、粪便、血浆等组织样品中出现高Septin 9甲基化的本底水平。综上，证据7-9证明结直肠癌组织样品与其他样品（如肠流出物、尿样、粪便、血样）存在显著不同（参见证据7-9）。在无相应试验证据的情况下，权利要求1-29对于“样品”的概括包含了专利权人推测的内容，而其效果又难于预先确定和评价，因此其概括的保护范围得不到说明书的支持。
（三）本专利权利要求7-20、23-25和27的保护范围不清楚，不符合专利法实施细则第20条第1款的规定：
1、权利要求7和8以及9-20中 “由此至少部分地提供至少检测和/或分类癌症之一”，其中“至少部分地”含义不清楚；
2、权利要求8-20中关于扩增物的性质以及所述的转化试剂的含义不清楚；
3、权利要求23-25均涉及经处理的核酸在制备试剂盒中的用途，但本领域技术人员不清楚这些经处理的核酸在试剂盒中的作用；
4、权利要求27对所从属的权利要求26的寡核苷酸的碱基长度限定不一致，导致权利要求27的保护范围超出了权利要求26的保护范围。
（四）本专利权利要求1、7、8、21、23-25和29没有限定甲基化的阈值水平，而在不限定阈值的情况下，本领域技术人员显然无法实现对癌症的检测，因此所述权利要求缺少必要技术特征，不符合专利法实施细则第21条第2款的规定。
（五）本专利权利要求1、8-20、24-27超出了原母案申请（即证据6）公开的范围，不符合专利法实施细则第43条第1款的规定：
1、本专利权利要求1涉及“用于确定Septin 9基因或基因组的Septin 9序列的甲基化水平的装置”，然而，在本案的母案（参见证据6说明书35页第1段、第3段、49页第2段、75页第1段和78页第2段）中并没有该“装置”的记载。
2、本专利权利要求8-20、24-27均涉及序列SEQ ID NO: 4-9。然而，母案中均未记载具有该技术特征——序列SEQ ID NO:4-9的上述技术方案 。
（六）本专利权利要求7 -20不具有专利法第22条第2款规定的新颖性
1、权利要求7及其从属权利要求11、12相对于证据25不具备新颖性。
证据25（参见第4栏第15-30行、第40栏第15-52行、第24栏第28-45行、第17栏第43-45行、第30栏第5-20行）公开了将亚硫酸氢盐试剂制备成用于检测癌症，如结肠直肠癌的试剂盒的用途，以及将甲基化敏感内切酶试剂制备成用于检测癌症，如结肠直肠癌的试剂盒的用途，即，证据25公开了权利要求7的全部技术特征，因此权利要求7不具备新颖性。从属权利要求11、12的附加技术特征也被证据25（参见说明书第18栏第1段）公开，因此其也不具备新颖性。
2、权利要求8-10、13-20因不享有优先权，相对于证据24不具备新颖性
权利要求8限定了采用扩增酶和至少一种引物来扩增经胞嘧啶转化试剂处理后的基因组，但所有在先申请的优先权文件（证据17-23）中，其技术方案涉及的均是“以至少两种引物，而非至少一种引物，和扩增酶来扩增经处理的基因组或其片段”的技术方案，因此权利要求8及其从属权利要求9-10、13-20不享有优先权。
在上述权利要求不享有优先权的基础上，证据24构成现有技术，其公开了将亚硫酸氢盐试剂、扩增酶、至少两种包含至少16个核苷酸长的引物用于检测乳腺癌或区分乳腺癌与其它癌症（包括结肠癌症）的方法（参见权利要求1、2、4、12-14、26，实施例1以及附件3的序列比对表），即公开了权利要求8的全部技术特征，因此权利要求8不具备专利法第22条第2款规定的新颖性。基于相同的理由，权利要求9-10、14-20也相对于证据24不具备新颖性。
另外，从属权利要求13的步骤d)表述具有明显错误，但将其修改成步骤c)后，基于相同的理由，权利要求13也相对于证据24不具备新颖性。
（七）本专利权利要求1-29不具有创造性，不符合专利法第22条第3款的规定
1、以证据24作为最接近现有技术时，权利要求8、9-10和13-20相对于证据24、或证据24与证据10的结合不具备创造性
权利要求8与证据24的区别特征仅在于：证据24未明确指明将标志物MSF (即本专利的SEQ ID NO: 3)的甲基化状态用于癌症的检测和/或分类。然而，证据24教导了可以使用亚硫酸氢盐和扩增酶及引物分析SEQ ID NO: 3的甲基化状态，用于 “检测和/或分类个体中的癌症（如结肠癌症与乳腺癌）”，而且证据10也已经给出septin9基因序列的甲基化状态在结肠癌细胞和正常细胞中存在差异的技术启示，因此权利要求8以及9-10、13-20相对于证据24或者证据24与证据10的结合不具备创造性。
2、以证据12作为最接近现有技术时，权利要求1-25相对于证据12与证据10（任选的还与证据11和/或公知常识）的结合、证据12与证据13或14（任选的还与证据10、证据11和/或公知常识）的结合不具备创造性
证据12公开了DNA甲基化标志物能够用于诊断癌症，包括结直肠癌和肝癌，权利要求1与之相比的区别特征仅在于：权利要求1具体限定了DNA甲基化标志物是Septin9，权利要求1实际解决的技术问题是提供一种可能的甲基化水平与癌症有关联的DNA甲基化标志物基因。然而，
（1）证据10给出了Septin9基因的表达水平因其甲基化而在癌症细胞中变化，因此本领域的技术人员有动机选择Septin9基因作为证据12中所指出的候选DNA甲基化标志物，因此，权利要求1相对于证据12与证据10的结合不具备创造性。在此基础上，从属权利要求2-6的附加技术特征分别被证据12（参见摘要、第299页第2段、第301页最后1段）、证据11（参见第11页最后一段）所公开，因此其也不具备创造性。基于相同或相似的理由，权利要求7及其从属权利要求11-12、权利要求8及其从属权利要求9-10和13-20、权利要求21-25相对于证据12、证据10和证据11和/或公知常识（例如证据15公开了亚硫酸氢钠作为亚硫酸氢钠和焦亚硫酸氢钠的混合物，以及甲基化敏感限制酶、扩增酶和针对靶区域特定CpG的引物检测CpG甲基化的方法是本领域的常用的检测甲基化的方法）的组合均不具备创造性；或者，
（2）在上述区别特征的基础上，证据13或证据14都给出了Septin 9异常甲基化与肿瘤有关联的启示，因此权利要求1-6相对于证据12结合证据13或证据14不具备创造性。基于相同或相似的理由，权利要求7及其从属权利要求11-12、权利要求8及其从属权利要求9-10和13-20、权利要求21-25相对于证据12和证据13或14的组合，或相对于证据12、证据13或14和公知常识/证据11（以及任选的证据10）的组合均不具备创造性。
3、以证据25作为最接近现有技术时，权利要求1-25相对于证据25与证据10（任选的还与证据11、证据12和/或公知常识）的结合、证据25与证据13或14（任选的还与证据10、证据11、证据12和/或公知常识）的结合不具备创造性
权利要求1与证据25的区别特征仅在于：权利要求1限定检测Septin9基因，而证据25检测CACNA1G基因，权利要求1实际解决的技术问题是提供另外一种可能的甲基化与癌症有关的替换CACNA1G基因的甲基化标志物。然而，
（1）证据10公开了Septin9的β转录本和γ转录本，与证据25中的CACNA1G均位于具有LOH的染色体区域，用DNA甲基化抑制剂处理后，表达均上升，因此本领域的技术人员有动机选择Septin9基因取代证据25的CACNA1G基因作为标记，因此，权利要求1相对于证据25结合证据10不具备创造性。在此基础上，基于相同或相似的理由，在此基础上，从属权利要求2-6的附加技术特征分别被证据10、证据12（参见摘要）、证据25（参见权利要求5、第1栏发明背景下第一段最后7行、第18栏第4-20行以及最后一段）所公开，因此其相对于证据25和证据10的组合，或者证据25、证据10和证据12的组合也不具备创造性。基于相同或相似的理由，权利要求7及其从属权利要求11-12、权利要求8及其从属权利要求9-10和13-20、权利要求21-25相对于证据25和证据10的组合，或者证据25、证据10和证据12的组合，或者证据25、证据10和证据11的组合，或者据25、证据10，以及任选的公知常识/证据11的组合不具备创造性；或者，
（2）在上述区别特征的基础上，证据13或证据14都给出了Septin 9异常甲基化与肿瘤有关联的启示，因此权利要求1-6相对于证据25和证据13或14的组合，或者证据25、证据13或14和证据12的组合不具备创造性。基于相同或相似的理由，权利要求7及其从属权利要求11-12、权利要求8及其从属权利要求9-10和13-20、权利要求21-25相对于证据25和证据13或14（以及任选的证据10）的组合，或相对于证据25、证据13或14，以及任选的公知常识/证据11（以及任选的证据10）的组合，不具备创造性。
4、以证据16作为最接近现有技术时，权利要求1-25相对于证据16和证据10或12或13或14（任选的还与证据10、证据12、证据11和/或公知常识）的结合不具备创造性
权利要求1与证据16的区别特征仅在于：证据16检测的是Septin9基因的表达，而本专利权利要求1检测的是Septin9基因的CpG甲基化。然而，
（1）证据12公开了基于靶基因的表达水平与癌症的关系，能够选择作为DNA甲基化标志物的候选基因，其中甲基化一般发生在CpG二核苷酸或CpG位置，因此检测Septin9的甲基化时，本领域技术人员能够显而易见地知道需要检测的是Septin9序列内的CpG甲基化，致使权利要求1相对于证据16结合证据12不具备创造性。同时，证据10、证据13或证据14都给出了SEPT9基因的甲基化与肿瘤之间存在关联的启示，因此权利要求1相对于证据16、证据10、证据13或证据14的组合也不具备创造性。同理，从属权利要求2-6相对于证据16和证据12的组合，或证据16和证据10或13或14（任选地和证据12）的组合也不具有创造性。
（2）在此基础上，基于相同或相似的理由，权利要求7及其从属权利要求11-12、权利要求8及其从属权利要求9-10和13-20、权利要求21-25相对于证据16和证据12或13或14（任选地和证据10）的组合、或证据16和证据10或证据11的组合，或证据16和证据12或13或14和证据11/公知常识（任选地和证据10）的组合、或证据16和证据10和证据11/公知常识的组合均不具备创造性。
5、以证据25为最接近的现有技术（任选地与公知常识组合），权利要求26-29不具有创造性
权利要求26与证据25的区别在于：①限定了改变未甲基化的胞嘧啶碱基的试剂为亚硫酸氢盐试剂；②将扩增包含CpG的多核苷酸的引物限定为等同或互补于SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:15的序列。然而，本领域公知且证据25也公开了亚硫酸氢盐是一种改变未甲基化的胞嘧啶碱基的试剂，并公开了寡核苷酸引物是与待扩增靶核酸基本互补的核苷酸。因此，权利要求26相对于证据25（任选地与公知常识组合）不具有创造性。基于相同理由，权利要求27-29也不具有创造性。
6、本专利的权利要求1-29未取得预料不到的技术效果
本专利说明书的公开数据仅说明了在Septin9的一个很小特定130bp区域的CpG平均甲基化水平，在结直肠癌细胞和正常全血细胞之间存在差异，但基于这样的差异，本领域技术人员无法使用septin9基因及其序列(包括SEQ ID NO:1-3及包含至少一个CpG甲基化的靶区域)的甲基化来解决本发明所要解决技术问题，因此权利要求1-29未取得预料不到的技术效果，致使本专利的权利要求1-29不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备创造性。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年12月11日受理了上述无效宣告请求，并分别于2018年12月11日及2019年01月10日将上述文件转送给了专利权人。
专利权人于2019年01月28日提交了答复意见书和如下反证1-2：
反证1：“DNMT1 and DNMT3b cooperate to silence genes in human cancer cells”， Ina Rhee等，Nature, 第416卷, 552–556, 公开日2002年4月4日及摘要中文译文；
反证2：“The Dnmt1 DNA-(cytosine-C5)-methyltransferase Methylates DNA Processively with High Preference for Hemimethylated Target Sites”，Andrea Hermann等，The Journal of Biological Chemistry，第279卷, 第46期, 第48350–48359页, 公开日2004年11月12日，第48350页-48351页、48357页的部分中文译文。
专利权人于2019年02月25日又再次提交了补充意见书和如下反证3：
反证3： Multimodality expression profiling shows SEPT9 to be overexpressed in a wide range of human tumours，Michael Scott等人，Oncogene (2005) 24, 4688–4700，公开日 2005 年 03月 14日，及其部分中文译文。
同时，专利权人还提交了修改的权利要求书（共28项）。与授权公告的权利要求书相比，所作修改为将原从属权利要求3的附加技术特征并入原权利要求1、7-8、21、23-25中，并删除了原权利要求3，将原权利要求8中的“至少一种引物”修改为“至少两种引物”，同时适应性调整了权利要求的编号和引用关系。
修改后的权利要求1、6、7、20、22-24（对应于原权利要求1、7、8、21、23-25）如下：
“1. 用于确定Septin 9基因或基因组的Septin 9序列的甲基化水平的装置在制备用于检测和/或分类个体中癌症的方法的试剂盒中的用途，
其中所述方法包括确定分离自所述个体的生物样品中Septin 9基因或基因组的Septin 9序列的甲基化水平，其中CpG甲基化表明所述癌症存在或其种类，其中所述癌症为肝细胞癌或结肠直肠癌。”
“6. 区分基因组DNA至少一个靶区域内甲基化和未甲基化CpG二核苷酸的至少一种试剂或成组试剂在制备用于检测和/或分类个体中癌症的方法的试剂盒中的用途，其中所述方法包括使从所述个体生物样品中分离的基因组DNA与所述至少一种试剂或成组试剂接触，
其中所述靶区域等同于或互补于至少一种分别选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3的序列的至少16连续核苷酸的序列，其中所述连续核苷酸包含至少一个CpG二核苷酸序列，由此至少部分地提供对癌症的检测和/或分类，其中所述癌症为肝细胞癌或结肠直肠癌。
7. 将5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或在杂交性能方面可检测地不同于胞嘧啶的其它碱基的一种或多种试剂，和
扩增酶和至少两种包含至少9核苷酸连续序列的引物
在制备用于检测和/或分类个体中癌症的方法的试剂盒中的用途，其中所述方法包括：
a)提取或以其它方式从所述个体生物样品分离基因组DNA；
b)用所述一种或多种试剂处理a)的所述基因组DNA或其片段；
c)使所述经处理的基因组DNA或其经处理的片段与所述扩增酶和所述至少两种引物接触，所述引物包括至少9核苷酸的连续序列，其等同于或互补于选自SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：15及其互补序列的序列，其中所述经处理的基因组DNA或其片段被扩增以产生至少一种扩增产物或不被扩增；以及
d)基于所述扩增物是否存在或其性质，确定选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3的序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平，或者反映选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3的序列的多个CpG二核苷酸平均甲基化状态或水平的均值或值，由此至少部分地提供至少检测和分类癌症之一，其中所述癌症为肝细胞癌或结肠直肠癌。”
“20. 一种或多种甲基化敏感限制酶和
扩增酶和适于扩增具有选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3的序列的至少一个CpG二核苷酸的至少两种引物
在制备用于检测和/或分类癌症的方法的试剂盒中的用途，其中所述方法包括：
a)提取或以其它方式从得自所述个体的生物样品分离基因组DNA；
b)以一种或多种甲基化敏感限制酶消化a)的所述基因组DNA或其片段；
使b)的DNA限制酶消化产物与所述扩增酶和所述至少两种引物接触；以及
c)基于扩增产物存在与否，确定选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3的序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平，由此至少部分 地提供至少检测和分类癌症之一，
其中所述癌症为肝细胞癌或结肠直肠癌。”
“22. 衍生自基因组SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3的经处理的核酸在制备用于检测和/或分类癌症的试剂盒中的用途，其中所述处理适合于将所述基因组DNA序列的至少一个未甲基化的胞嘧啶碱基转化至尿嘧啶或在杂交上可检测地不同于胞嘧啶的其它碱基，其中所述癌症为肝细胞癌或结肠直肠癌。
23. 核酸在制备用于检测和/或分类癌症的试剂盒中的用途，所述核酸为选自SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：15的经处理的基因组DNA序列及其互补序列的至少16连续核苷酸，其中所述处理合适于将所述基因组DNA序列的至少一个未甲基化的胞嘧啶碱基转变为尿嘧啶或在杂交上可检测地不同于胞嘧啶的其它碱基，其中所述癌症为肝细胞癌或结肠直肠癌。
24. 核酸在制备用于检测和/或分类癌症的试剂盒中的用途，所述核酸为选自SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：15的经处理的基因组DNA序列及其互补序列的至少50连续核苷酸，其中所述处理合适于将所述基因组DNA序列的至少一个未甲基化的胞嘧啶碱基转变为尿嘧啶或在杂交上可检测地不同于胞嘧啶的其它碱基，其中所述癌症为肝细胞癌或结肠直肠癌。”
专利权人认为：
（一）关于专利说明书是否符合专利法第26条第3款的规定
1、关于“根据本专利说明书中给出的技术手段，本领域技术人员并不能解决发明所要解决的技术问题”
首先，证据1以全基因组为讨论对象，其内容不适用于单个基因的情形。其次，本专利中的“甲基化水平”并不仅仅表示甲基化状态的存在或不存在，其表示的可以是甲基化状态的百分比、份数、比率、比例或程度，即便健康人DNA中的特定区域也存在一定程度的甲基化，根据本专利的技术方案，本领域技术人员仍能够根据癌组织和健康组织之间特定区域甲基化水平的区别来进行判断。因此，本领域技术人员能够采用该技术手段解决本发明的技术问题。
2、关于“本专利说明书未公开试验数据”
（1）关于本专利所检测序列范围的代表性。当本领域技术人员谈论甲基化这一概念时，是指一个特定“基因”总体上甲基化程度是否上升或下降，指的是整体上甲基化位点的数量、出现概率等总的变化，至于其内部特定某一具体位点是否被甲基化，或者该具体位点被甲基化的概率是否提高，均不影响本领域技术人员对该基因整体上的判断。证据3从未表示一个特定基因内甲基化程度是否等同，而是指整个序列（例如整个DNA分子，或整个染色体的DNA序列）中所有CpG位点的甲基化水平。这与本发明的贡献并不矛盾。本发明所作出的贡献是基于将一个基因整体作为评价甲基化状态的单位。
（2）反证1-2证明DNA甲基转移酶的这种连续行进性作用机制必然导致连续DNA片段上甲基化趋势的一致性，即一个基因上甲基化趋势的一致性。
（3）本专利说明书实施例2、3中明确记载了使用了结肠直肠癌组织、结肠直肠的正常临近组织、以及全血作为测试样品。
（4）说明书实施例3中涉及“NAT”属于笔误，不是非临近结肠组织，而是“正常的临近组织，即，Normal Adjacent Tissue”。
（5）实施例4的样品设计是合理的，并且图3、4表示的是分子水平（即DNA位点水平）的甲基化程度区分，已经满足统计学要求的情况下，即可转化为有意义的诊断标志。
综上，本专利说明书已经充分公开所保护的技术方案，符合专利法第26条第3款的规定。
（二）关于本专利是否符合专利法第26条第4款的规定
在以上意见的基础上，专利权人还认为：
（1）本专利说明书从未将“CpG甲基化状态或水平”定义为高于临界值（零）的任何情况。上述情况仅仅是对CpG甲基化水平数据的处理方式之一，并且该“临界值（零）”也并不意指化学上完全不存在甲基化，而是基于统计学的指定值。
（2）本专利经修改后，权利要求均限定了具体的癌症类型。增殖性疾病中，良性细胞增殖性组织的生理状态与正常组织更为接近，而与恶性增殖性组织不同。本发明能区分正常组织和癌症组织，自然能区分良性细胞增殖性组织。
（3）本专利中的数据证明本专利的方法能够检测到极低含量的DNA成分，一旦例如血液样品中存在循环肿瘤DNA，用本方案的特异性检测方法就仍然能够检出，证据5指出患者全血中存在“可检出的循环肿瘤细胞”，支持了本发明的技术效果。在此基础上，选择含有Septin 9甲基化的DNA的样品，属于常规技术。
（三）关于相关权利要求的保护范围是否清楚
上述表述或是本领域常用的表达方式，或是本领域结合说明书容易理解的，因此其保护范围是清楚的。
（四）关于相关权利要求是否缺少必要技术特征
本领域技术人员知道如何具体使用所述装置或核酸或试剂盒来实现癌症的检测和/或分类，这属于本领域的常规技术手段，并且“Septin 9甲基化状态或水平”并不仅在某一特定值以上，因此没有必要在权利要求中加以限定。
（五）关于相关权利要求是否超出原申请的公开范围
请求人所指出的上述内容或属于普遍允许的表达方式，或属于母案申请中的明显错误，本领域技术人员根据对本发明公开内容的理解，可以毫无疑义地确认正确内容，因此并没有超出原申请的公开范围。
（六）关于新权利要求6-19（即原权利要求7-20）是否具备新颖性
（1）新权利要求6、10-11限定了所述试剂对于靶区域的甲基化和未甲基化CpG二核苷酸能够进行区分，而证据25并未公开任何与检测靶标相关的特征，因此所述权利要求相对于证据25具备新颖性。
（2）由于专利权人已经根据原权利要求21中记载的“至少两种”将原权利要求8中的“至少一种”修改为“至少两种引物”，因此，原权利要求8（即新权利要求7）的优先权成立，证据24并不能作为现有技术使用，而且，由于证据24并未公开能检测肝癌、结直肠癌等特征，因此修改后的权利要求7-9、12-19相对于证据24具备新颖性。
（五）关于修改的权利要求1-28是否具有创造性
1、以证据24作为最接近现有技术时，新权利要求7-9和12-19相对于证据24、或证据24和证据10的结合是否具备创造性
（1）由于证据24提出了相反教导，因此修改的权利要求7以及8-9、12-19相对于证据24具备创造性；或者，
（2）在上述区别特征的基础上，证据10涉及SEPTIN9基因的多个不同剪接变体在卵巢肿瘤细胞系及其他肿瘤细胞系中的表达情况，其并未证明septin9剪接变体与septin9基因区域的甲基化之间存在任何关联，另外，由于证据10未提供任何结直肠组织的正常细胞作为对照，也不能证明该变体水平与结直肠癌发生相关，进一步地，反证3证明其剪接变体水平与是否发生结直肠癌并无关联，因此，修改后的权利要求7以及8-9、12-19相对于证据24结合证据10具备创造性。
2、以证据12作为最接近现有技术时，修改的权利要求1-24相对于证据12和证据10（任选的还与证据11和/或公知常识）的结合、证据12和证据13或14（任选的还与证据10、证据11和/或公知常识）的结合是否具备创造性
权利要求1与证据12的区别特征至少是：权利要求1具体限定了DNA甲基化标志物是Septin9。然而，
（1）如上所述，证据10和反证3的结合提供了相反教导，使得本领域技术人员无法预期该技术方案能够实现检测肝癌或结肠癌的效果，因此修改的权利要求1-6相对于证据12结合10具备创造性。在此基础上，证据11也未公开或教导与上述区别特征有关的任何技术方案，基于相同或相似的理由，权利要求7-24相对于证据12、10和证据11的组合也具备创造性。
（2）在上述区别特征的基础上，证据13中关于甲基化的内容实际上所引用的文献就是证据10，其他部分不涉及septin9甲基化，也不涉及肝细胞癌或结肠直肠癌，证据14也未建立septin9甲基化与任何一种癌症之间的关系，因此权利要求1相对于证据12结合证据13或证据14具备创造性。在此基础上，基于相同或相似的理由，权利要求2-24相对于证据12、证据13或14与公知常识/证据11（任选的证据10的组合）也具备创造性。
3、以证据25作为最接近现有技术时，修改的权利要求1-24相对于证据25和证据10（任选的还与证据11、证据12和/或公知常识）的结合、证据25和证据13或14（任选的还与证据10、证据11、证据12和/或公知常识）的结合是否具备创造性
权利要求1与证据25至少具有区别特征：限定了DNA甲基化标志物是Septin9。然而，
（1）如上所述，证据10结合反证3给出相反教导；证据12没有公开Septin9甲基化与结直肠癌或其他任何癌症之间的关系，因此，权利要求1相对于证据25结合证据10，或证据25、证据10和证据12的组合具备创造性。在此基础上，基于相同或相似的理由，权利要求2-24相对于证据25结合证据10（任选的还与证据11、证据12和/或公知常识）具备创造性。
（2）在上述区别特征的基础上，证据13或证据14并未给出任何技术启示，因此权利要求1相对于证据25结合证据13或证据14，或证据25、证据13或14和证据12的组合具备创造性。在此基础上，基于相同或相似的理由，权利要求2-24相对于证据25结合证据13或14（任选的还与证据10、证据11、证据12和/或公知常识）也具备创造性。
4、以证据16作为最接近现有技术时，修改的权利要求1-24相对于证据16和证据10或12或13或14（任选的还与证据10、证据12、证据11和/或公知常识）的结合是否具备创造性
权利要求1与证据16的区别特征在于：限定以Septin9基因DNA甲基化为标志物。然而，证据12从未教导基因的表达水平与其甲基化程度存在任何必然性联系，因此无法通过证据16结合证据12得到权利要求1的技术方案，对于证据10、13、14，如上述所述，未提供任何技术启示。在此基础上，基于相同或相似的理由，权利要求2-24的特征相对于结合证据12或13或14（任选的还与证据10、证据12、证据11和/或公知常识）具备创造性。
5、以证据25为最接近的现有技术（任选地与公知常识组合），修改的权利要求25-28是否具有创造性
权利要求25仅仅提供平台性的测序技术，没有提供任何与肝癌或结直肠癌检测的教导和生物靶标，并且现有技术也未公开septin9的甲基化可作为癌症进行检测的靶标，因此，权利要求25-28相对于证据25任选地与公知常识的结合具备创造性。
6、关于修改的权利要求1-28的技术效果
本专利实施例证明了CRC和血液样品中测定靶序列SEQ ID NO:1的甲基化敏感性、特异性，还证明了本技术方案在其他癌症、非癌细胞中的甲基化水平，足以证明本发明的技术效果。
合议组于2019年02月01日、2019年03月08日将上述文件转送请求人。
请求人于2019年03月15日补充提交了如下证据（编号续前）：
证据26： DNA Methylation and Cancer Therapy-Springer US (2005)，ISBN:0-306-47848-X; Moshe Szyf Ph.D.，及其中文译文1页；
证据27： DNA methylation patterns in hereditary human cancers mimic sporadic tumorigenesis，2001 oxford university press Human molecular Genetics, 2001, 第10卷, 第26期, 第3001-3007页，及其中文译文1页
证据28： Andrea Hermann等, The Dnmt1 DNA-(cytosine-C5)-methyltransferase Methylates DNA Processively with High Preference for Hemimethylated Target Sites, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 第279卷, 第46期, 第48350-48359页, 2004 (即反证2)，及其中文译文1页。
请求人于2019年04月17日再次提交了补充意见陈述书和关于证据3、证据4、证据14、证据24的补充译文，以及证据29-30（编号续前）：
证据29：Multimodality expression profiling shows Septin9 to be overexpressed in a wide range of human tumours, Michael Scott et al., Oncogene (2005), 24, 4688-4700，2005年3月14日（即反证3），及其中文译文3页
证据30：DNA methylation Biochemistry and Biological Significance，Edited by Aharon Razin, Howard Cedar, and Arthur D. Riggs，? 1984 by Springer-Verlag New York Inc. ISBN:0387960384，及其中文译文1页。
结合上述证据，请求人认为：
（1）证据3、4和14的补充译文，以及证据30，可以证明利用5-氮杂胞苷进行基因甲基化研究是本领域常规技术手段。
（2）反证3的补充译文（即证据29）证明反证3的图5B中各个组分之间的电泳结果不具备可比性，无法得出β变体在正常结肠和卵巢组织的表达水平的关系。
（3）证据24的补充译文证明：
①可以将MSF的CpG甲基化水平用于检测CRC中，因此权利要求8不具备新颖性。
②MSF上并非所有的CpG位置都有类似的甲基化水平，只有癌变组织中表现出比正常细胞高的甲基化水平，可以区分癌细胞和正常细胞。
③证据24还能证明本发明公开不充分：虽然MSF的甲基化水平可以区分癌细胞和正常细胞，但无法区分具体癌症，从而证明并非任何septin9基因组中的任何CpG甲基化都能特异性检测CRC。
合议组分别于2019年04月11日、2019年04月23日将上述补充意见书和证据转送专利权人，并于2019年04月18日向双方当事人发送口审通知书，定于2019年05月07日进行口头审理。
口头审理如期举行，合议组对本案的所有无效宣告理由和证据进行了调查，双方当事人均充分陈述了各自的意见，在此基础上，合议组确认并记录了如下事实：
（1）专利权人的答复意见书以2019年02月25日提交的补充意见书和修改的权利要求1-28为准，并当庭提交证据1和证据24的补充译文，合议组将上述补充译文当庭转送请求人。专利权人指出，原权利要求21中已经记载了“至少两种”的内容，并且以说明书第0054段为依据修改了权利要求7，这种放弃端值的修改方式，属于放弃并列技术方案；
（2）请求人认为专利权人对原权利要求8（即修改后的权利要求7）的修改不符合无效宣告程序中的修改方式，因此应以授权公告的权利要求作为审理基础。
（3）关于权利要求的保护范围能否得到说明书的支持，请求人认为，首先，证据7-8表明利用甲基化标志物并不能区分癌症患者和健康个人的血清，并且证据5和证据8也能表明癌症患者和健康个人的全血甲基化水平没有差异。然而，本专利说明书仅证明直接用结肠癌组织样品进行检测可以实现诊断目的，未对其他样品（如肠流出物、尿样、粪便、血样）进行检测。因此，所有权利要求对于“样品”的概括不合理，其得不到说明书的支持；其次，本专利说明书实施例1-4仅仅证明了位于SEQ ID NO:3中的约130碱基（以下称bp)的靶区域能够区分来自结肠癌组织样品的甲基化水平与正常组织的甲基化水平，但未证明其他的靶区域也能实现预期效果（例如实施例5）。
对此，专利权人认为：首先，本发明的技术贡献在于首次发现该基因的甲基化状态与癌症的关联性，从而提供通过血液检测来诊断癌症的用途，并不是在现有的甲基化区域进行的诊断研究，因此可以获得更大的保护范围；其次，本专利说明书实施例5以及图5-29还公开了不同于上述130bp的其他靶区域的检测效果。
（4）合议组当庭告知：鉴于双方对对方的证据译文准确性均无异议，且针对对方证据互相提交了补充译文，因此一并考虑双方提交的证据译文及补充译文，对此双方无异议。
（5）合议组当庭告知：专利权人提交的修改后权利要求书符合无效宣告程序的修改方式，即口头审理的文本以修改的权利要求书和授权公告的其他文本为基础，请求人坚持认为权利要求8的修改不符合无效阶段关于修改方式的规定。
2019年05月14日，请求人提交庭后代理词，除了就口头审理时的争议焦点重申了意见外，还进一步指出，由于实施例5没有证明检测的甲基化在癌症患者与健康个体之间是否存在差异，因此本专利说明书实施例5的数据无法证明所述130bp之外的不同区域、不同的CpG位置具有不同的甲基化水平，能够用于检测癌症；此外，已有的审查历史和司法实践均认为，将术语“至少一种”修改为“至少两种”不属于审查指南所规定的可接受的修改方式，这种修改方式不属于并列技术方案的删除。
2019年05月15日，专利权人提交庭后代理词，除了就口头审理时的争议焦点重申意见外，还进一步指出，实施例5设计了10对引物，并通过这些引物得到了分别跨越了SEQ ID NO:1-3中的多个区域的10个扩增子，图5-29的结果能够证明已经确定为130bp区段高甲基化的样品中，其他甲基化位点也像130bp区段一样发生高甲基化，这说明该方法可以应用于血液样品，并对其甲基化水平成功进行测定。
至此，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
（一）法律适用
本案属于申请日在2009年10月01日之前的专利申请，故适用2000年08月25日修订的专利法以及2002年12月28日修订的专利法实施细则。
（二）关于审查文本
专利权人在2019年02月25日提交的修改后的权利要求书中，将从属权利要求3的附加技术特征并入原权利要求1、7-8、21、23-25中，删除了从属权利要求3，并将原权利要求8（即新权利要求7）中“至少一种引物”修改为“至少两种引物”。请求人认为，对于权利要求8的修改，“至少一种引物”作为一个整体，是一个技术特征，而非多个技术特征的并列选择，因此这种修改方式增加了未包含在授权权利要求书中的技术特征，既不属于并列技术方案的删除，也不符合专利审查实践和司法实践，因此不属于《审查指南》所规定的可接受的修改方式。
对此，合议组认为：修改后《审查指南》第四部分第三章第4.6.2节第1段关于无效阶段的修改部分规定，“在满足上述修改原则的前提下，修改权利要求书的具体方式一般限于权利要求的删除、技术方案的删除、权利要求的进一步限定、明显错误的修正”，“权利要求的进一步限定指在权利要求中补入其他权利要求中记载的一个或者多个技术特征，以缩小保护范围”。
本案中，对于原权利要求1、7-8、21、23-25的修改方式，请求人对此未提出异议，经审查，上述修改符合《审查指南》的相关规定。对于原权利要求8的修改，由于本专利说明书第0002、0040-0041段记载了本发明的“方法、标志物、核酸、核酸阵列和试剂盒可用于诊断癌症，尤其是结直肠癌和/或肝癌”，说明书第0054段记载了包括“至少两种包含至少9核苷酸连续序列的引物”，并且原权利要求21（即新权利要求20）中明确限定了“选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3的序列的至少一个CpG二核苷酸的至少两种引物”的技术特征，可见，该修改内容符合专利法第33条的规定，同时其修改方式属于“将其他权利要求中记载的技术特征并入以缩小了原权利要求的保护范围”的方式，因此属于上述对“权利要求的进一步限定”的修改方式，符合《审查指南》第四部分第三章第4.6.2节关于修改方式的规定。因此，本无效宣告审查决定以专利权人于2019年02月25日提交的权利要求书（共28项）和本专利的授权公告时的其他文本为审查基础。
（三）关于证据的认定和无效宣告请求的理由、范围
关于证据1-30，专利权人认为：
①证据3的封面上记载“? 2005 by CRC Press LLC”，表明其是2005年公开，可能晚于本专利的优先权日。同时由于公证书记载的网络公开时间与纸件出版日期不一致，无法确认其确切的公开时间；
②证据8、9、24的公开日晚于本专利的最早优先权日，不能作为评价本专利的现有技术；
③请求人未结合证据26-30具体陈述理由，所述证据应当不予接受。
请求人对反证1-3及其译文、专利权人提交的证据1、24的补充译文无异议，但认为：
①证据3属于教科书，相应的公证书涉及根据证据3的ISBN出版号在出版社网站上检索的出版日期，基于ISBN出版号的唯一性，可以证明证据3的公开日期早于本专利的优先权日；
②证据8、9只是为了说明客观事实，用来说明样品来源，证据24是当优先权不成立时用于评价本专利是否具有新颖性的对比文件。
③证据26-30是针对专利权人意见陈述作出的针对性答辩，其中证据26-27用于反驳专利权人论点和佐证证据1，证据28-29是对专利权人的反证进行的补充译文，证据30属于公知常识证据，相关证据本身的译文内容就是针对性的答复意见，因此所述证据均符合无效宣告程序中的举证原则。经查，
①请求人当庭提交了证据3的原件和用于证明其出版日期的公证书，其中公证书记载了在出版社网站（www.crcpress.com）通过证据3中记载的出版号（ISBN 0-8493-2050-X）查询的该书出版日期早于2005年。基于请求人提交的公证书可以证明从该出版社网站查询到证据3的电子出版日期，由于出版社CRC PRESS为美国的专业教材和参考工具书的知名出版社，长期提供专业书籍的纸件文本和在线电子文本的服务，存在较高的公信度，且同一出版号通常代表的应当是同一版本的图书，因此，对于同一版本的图书，以纸件出版的图书内容与在线电子版本的内容通常应当是一致的，在专利权人未能提供证据证明“纸件文本和电子文本的内容不一致”的情况下，可以依据上述公证书中记载的日期而认定证据3的网络公开日早于本专利的最早优先权日。
②请求人主张，其提交证据24的目的是在本专利的优先权日不成立的情况下，作为现有技术以评述本专利的新颖性和创造性，因此，该证据是否能够作为现有技术取决于本专利是否享有优先权。如上所述，修改后的权利要求7（即原权利要求8）的技术方案涉及 “以至少两种引物，和扩增酶来扩增经处理的基因组或其片段”的技术方案，由于本专利主张优先权的证据17-18等（参见权利要求21）均记载了上述技术方案，可见，本专利的优先权成立。因此，证据24作为在本专利优先权日后公开的专利文件不能作为现有技术评价上述权利要求的新颖性和创造性，合议组对以证据24作为对比文件评价新颖性和创造性的无效理由不再予以审理。
③请求人指出，其提交证据8、9是为了说明有关样品的客观事实。对此，合议组认为，虽然证据8-9的公开日晚于本专利的最早优先权日，但请求人提交证据8、9的直接目的并不是将其作为评价新颖性或创造性的现有技术文献来使用，而是为了证明具体的客观技术事实，相应的技术事实在证据5和7中也有类似记载，因此，合议组将结合证据5和7对证据8、9记载的上述客观技术事实予以考虑。
④证据26-28是请求人针对专利权人提交的反证而在指定期限补充的证据，其中证据26为公知常识证据，证据28是对反证2的补充译文，因此合议组予以考虑。由于证据27既非公知常识证据，请求人也未结合该证据说明具体理由，无法确定其是针对专利权人提交的反证补充的证据还是依据请求书中的理由提交的新证据，因此，合议组对其不予考虑。
⑤请求人于2019年04月17日提交的证据29是针对反证3的补充译文、证据30是公知常识证据，请求人在补充意见书中结合上述证据具体说明了理由，并且专利权人对上述证据的三性及其译文准确性无异议，因此合议组对此予以考虑。
请求人对反证1-3以及专利权人提交的证据1和证据24的补充译文均无异议，因此合议组予以认可。
在此基础上，根据请求人在口头审理中的意见，合议组最终确认的需要审理的无效理由和范围是：
①本专利说明书公开不充分，不符合专利法第26条第3款的规定；
②本专利权利要求1-28（相对于原权利要求1-29）得不到说明书的支持，不符合专利法第26条第4款的规定；
③本专利权利要求6-19、22-24、26（相对于原权利要求7-20、23-25、27）保护范围不清楚，不符合专利法实施细则第20条第1款的规定；
④本专利权利要求1、6-7、20、22-24和28（相对于原权利要求1、7-8、21、23-25和29）缺少必要技术特征，不符合专利法实施细则第21条第2款的规定；
⑤本专利权利要求1、7-19、23-26（相对于原权利要求1、8-20、24-27）超出了原母案申请公开的范围，不符合专利法实施细则第43条第1款的规定；
⑥本专利权利要求6、10-11（相对于原权利要求7、11-12）相对于证据25不具备专利法第22条第2款规定的新颖性；
⑦本专利权利要求1-28（相对于原权利要求1-29）不具有创造性，不符合专利法第22条第3款的规定，所依据的证据为：据12结合证据10（任选的还与证据11和/或公知常识）、证据12结合证据13或14（任选的还与证据10、证据11和/或公知常识）；证据25结合证据10（任选的还与证据11、证据12和/或公知常识）、证据25结合证据13或14（任选的还与证据10、证据11、证据12和/或公知常识）；证据16结合证据10或12或13或14（任选的还与证据10、证据12、证据11和/或公知常识）；证据25（任选地与公知常识组合）。
（四）关于专利法第26条第4款
专利法第26条第4款规定，权利要求书应当以说明书为依据，说明要求专利保护的范围。
权利要求书应当以说明书为依据的目的在于使权利要求的概括范围与说明书公开的范围相适应，权利要求概括的范围不应当超出说明书公开的范围，也不应当有损于权利人因公开其发明而应当获得的合理权益，因此，判断权利要求能否得到说明书的支持，应当站在本领域技术人员的角度，综合考察发明创造要解决的技术问题、权利要求的范围、说明书公开的整体内容、与发明创造有关的现有技术状况、发明的实际技术贡献、本领域技术人员的常识和其所具有的分析推理能力等多个因素进行综合判断。
1、关于权利要求1-28中样品范围概括不合理的无效理由
本专利权利要求1请求保护一种用于确定Septin 9基因或基因组的Septin 9序列的甲基化水平的装置在制备用于检测和/或分类个体中癌症的方法的试剂盒中的用途，其中所述方法包括确定分离自所述个体的生物样品中Septin 9基因或基因组的Septin 9序列的甲基化水平，其中CpG甲基化表明所述癌症存在或其种类，其中所述癌症为肝细胞癌或结肠直肠癌。
根据本专利说明书0040-0054段的记载可知，本专利基于Septin 9基因中的CpG甲基化状态或水平与癌症的关联性，来完成对个体中肝细胞癌或结肠直肠癌的检测和/或分类，其中所述所述生物样品选自细胞系、组织学切片、组织活检、石蜡包埋的组织、体液、粪便、结肠流出物、血样、尿，及其组合，其中优选血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液中分离的细胞。其中对于所述甲基化水平，根据本专利说明书第0071、0108、0170段的记载可知，所述CpG的甲基化水平指“CpG位置处的甲基化百分比、份数、比率、比例或程度”。由此可见，权利要求1的保护范围涉及通过对不同来源的样品的Septin 9基因中的CpG甲基化状态或水平进行检测来判断肝细胞癌或结肠直肠癌存在与否的技术方案。
然而，对于上述保护范围中涉及体液、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液中分离的细胞的技术方案而言，以及涉及粪便、结肠流出物的技术方案而言，本专利说明书实施例1-5仅仅验证了来自结直肠癌患者和正常个体的组织样品中的Septin 9基因存在CpG甲基化水平的差异，并没有验证来自结直肠癌患者的非组织样品（例如血样、体液、尿；和，结肠流出物、粪便）相对于正常个体中相应样品之间是否存在统计学显著性的差异。对此，合议组认为，
首先，虽然实施例中采集了血样进行检测，但其所采集的血样的来源是正常个体，是作为正常阴性对照使用的，实施例中并没有记载来自于患病个体的血样作为检测样品而非对照样品的内容。由于说明书中并未提供充分的实验数据表明正常人和患者的血样的Septin9基因的甲基化水平存在统计学差异，能够用于区分阴性和阳性样品，因此依据说明书中进行的实验，不能直接得出所述血样本身的Septin9基因的甲基化水平可以直接作为结肠直肠癌的诊断标记物；
其次，虽然本专利说明书已经证明了组织样本中Septin9基因的甲基化水平能够作为诊断标记物，专利权人也声称组织样本中的肿瘤细胞进入血液就同样能够实现原理相同的检测，本申请以血样作为阴性对照进行的检测结果表明，正常个体血液中Septin9基因甲基化水平虽然较低，但也是可以检测到的（参见实施例5的扩增子10，图22）。对此，合议组认为，即使血样中可能存在肿瘤细胞DNA或游离肿瘤DNA，由于其含量极低，且易于受到cf-DNA的干扰，即便能够检测到这些DNA的存在，也难以确定检测结果能够用于区分不同种类的样品。例如，证据5（表2）公开了结直肠癌患者7.5毫升全血中可以检出的循环肿瘤细胞数(CTC)平均仅为4±11个（中值5个），这表明在全血中来自循环肿瘤细胞的DNA含量极低；证据7也表明在确定无细胞DNA（即循环DNA，cf-DNA）在相同症状群体中区分前列腺癌与良性疾病的诊断潜力中，即使是同样来源于血液的血清或血浆中，也无法检测出DNA水平与前列腺癌之间的关联性（参见证据7第1396页右栏第2-4段），这说明循环DNA（cf-DNA）会对循环肿瘤DNA（ct-DNA）的检测准确度带来严重影响（作为印证，证据8、9中公开了与证据5、7相类似的内容）。因此，考虑到本专利是通过甲基化水平的高低作为标志，即是通过定量检测而非定性检测来进行阳性和阴性样品的区分，在血液中能检测到得DNA含量如此之低且难以克服背景干扰的情况下，上述数据不足以使本领域技术人员相信仅仅依据组织样品的检测结果，就能预测本发明能在血样中也能实现预期的技术效果。
再次，对于涉及尿、体液样品的技术方案而言，由于尿液形成于泌尿系统，与消化系统中的结直肠癌不直接接触，因此，通常情况下尿液中一般不含有来自结直肠癌组织的肿瘤细胞，而且专利权人也没有提供相应的证据证明尿液中存在结直肠癌肿瘤细胞，涉及体液的技术方案也存在与上述血样相似的问题，因此，在本专利说明书未公开能够通过检测尿液、体液样品中Septin9基因的甲基化水平来诊断结直肠癌的试验数据的情况下，本领域技术人员无法预料上述技术方案能够解决本专利所要解决的技术问题，基于上述相同的理由，涉及尿、体液样品的技术方案也得不到说明书的支持。
最后，对于涉及结肠流出物、粪便样品的技术方案而言，由于所述样品形成于肠腔并经肠道排出，直接接触结直肠癌组织，通常情况下，相应样品中含有相对较多数量的肿瘤细胞或脱落的肿瘤组织的可能性较高，而且，请求人既未举证证明结肠流出物、粪便样品中因存在细胞数量少、污染干扰等因素导致无法检测和区分直结肠癌患者和正常患者中Septin 9基因的甲基化水平，也未举证证明结肠流出物、粪便样品中相应基因甲基化水平的变化趋势和程度与组织样本存在较大差异。因此，在说明书已经验证了来自结直肠癌患者和正常个体的组织样品中的Septin 9基因存在CpG甲基化水平的差异，结肠流出物、粪便样品又直接接触结直肠癌组织，且请求人又未充分举证的情况下，请求人针对涉及结肠流出物、粪便的技术方案所提出的得不到说明书支持的上述无效理由不成立。
专利权人认为：
（1）本专利实施例中的相关数据足以证明本发明的方法能够检测到健康血液背景中极低含量的DNA成分，同时根据甲基化特异性的方法结合统计学方法加以分析和定性，可以给出合理的判断。例如，表6公开了本发明方法可以检测到健康血液中仅高于阈值0.0001的背景信号。表12所示ROC曲线也表明使用正常血液该数据能够对患癌与非癌组群进行明确的区分，据此得到的结果也能够体现该检测的灵敏度和特异性。因此，本专利说明书已经证明本发明方法具有良好的灵敏度。
（2）证据5恰好证明了可以从癌患者全血中检测循环肿瘤细胞，同时，证据12表明在高背景中检测少量的甲基化属于现有技术，这说明本领域技术人员能够从血液中分离和检测循环癌细胞（CTC）和癌症DNA（ctDNA）。
（3）本发明的技术贡献并不是在现有的甲基化区域进行的诊断研究，而在于首次发现该基因的甲基化状态与癌症的关联性，从而提供通过血液检测来诊断癌症的用途，因此可以获得更大的保护范围。并且，在本发明已经充分证明能够检测组织样品以及组织样品检测具有良好灵敏性和特异性的情况下，已经给本领域技术人员提供了是否患有疾病的可能性的参考方法，即使血液中可检出的CTC的量相对较少（但仍然存在），但仍存在一定量的ctDNA，使得本领域技术人员能够根据现有技术和公知常识容易地选择合理的生物样品（如血液、肠流出物等）以用于本发明的检测手段，并合理地预期本发明所实现的技术效果。
对此，合议组认为：
（1）虽然表6公开了通过说明书第0530-0550段的方法可以检测到健康血液中涉及序列SEQ ID NO:1（测定2）的仅高于阈值0.0001的背景信号，但其中所使用的血液样本是作为阴性对照的健康血样，并不包含任何阳性血样，所述方法仅能表明以组织样品作为检测对象的检测方法的灵敏性和特异性，并不能证明阳性结肠癌组织样本可替代阳性肿瘤血液样本并通过检测血样实现区分患癌与非癌组群的目的。
（2）如上所述，证据5已经证明对于晚期转移的结肠直肠癌患者，也只有非常微小数量的肿瘤细胞释放到全血（中值5个/7.5ml全血），相比而言，本领域公知成人每毫升全血中含有35-55亿红细胞、400-1000万白细胞。虽然证据12提及需要通过高灵敏度技术从DNA甲基化标志物的频率较低的体液（如痰、血清、血浆、尿液）中扩增微量甲基化DNA，但CpG甲基化普遍存在于正常基因中，体液样品中正常的CpG甲基化可能对具有特异表征作用的CpG甲基化造成背景干扰而导致其无法实现检测区分样品的目的，一种检测方式能否实现相应的区分，通常需要通过对阳性和阴性样品的检测来进行分析和对比，在缺少肿瘤阳性个体血液样本的甲基化水平的情况下，仅通过直接检测正常个体血液中的DNA甲基化水平难以建立其与疾病的关联性。
（3）如上所述，本专利仅证明了使用组织样品作为检测对象的检测方法能够实现最终的诊断目的，虽然组织样品和体液、血液中的细胞具有共同的基因组序列，但它们来源于不同的器官或组织，各种基因表达与否，以及基因的调控情况、途径也各不相同，以至于检测方式也存在明显区别。因此，这并非待检样品的简单替换。而涉及肿瘤DNA在不同待检样品中的存在方式和含量（如组织样品中肿瘤DNA的高度富集方式相比于游离在血样/体液中肿瘤DNA的极微量方式）、分离难度、背景DNA甲基化水平的干扰（如血样中的甲基化cfDNA）、现有技术给出的技术认知（如证据7教导的直接从来源于血液的血清或血浆中，也无法检测出循环DNA水平与前列腺癌之间的关联性）等影响因素的综合考虑，本领域技术人员难以从组织样品中获取的特定基因的甲基化数据直接预期血液等其他非组织样品的相同检测也存在相似或相同的区分度。此外，通过检测非组织样品（如血样、尿液）相比于现有的原位检测结直肠的癌变组织，明显具有临床上更好的便利性和应用前景，根据“保护范围与技术贡献相匹配”的专利保护原则，要获得对以非组织样本作为检测对象的技术方案的保护范围，专利权人理应为本领域技术人员提供足以信服的试验数据以证明其作出了相应的技术贡献，而不能仅仅使用检测组织样品的试验数据来代替检测非组织样品的试验数据。
综上，通过综合考察发明创造要解决的技术问题、权利要求的保护范围、说明书公开的整体内容、现有技术的发展水平、发明创造的技术贡献以及本领域技术人员的技术知识和分析能力等多个因素，在优先权日时本领域技术人员尚不能预料本发明能够通过检测血液等非组织样本而诊断相关癌症。
2、关于权利要求4-5、10-11、18-19中涉及“生物样品选自细胞系、组织学切片、组织活检、石蜡包埋的组织、粪便、结肠流出物，及其组合”的技术方案中，其概括的技术特征“CpG甲基化”不合理，导致其保护范围得不到说明书支持的无效理由
请求人认为，
（1）本专利的“CpG甲基化”和“甲基化状态或水平”是指在Septin 9基因或基因组的序列（或SEQ ID NO:1-3）中任何一个CpG或多个CpG位置上存在甲基化的任何情况。然而，证据1（参见第988页中间栏第2段和右栏第2段）公开了CpG位点甲基化广泛存在于正常细胞中，在个体的基因组中存在至少一个或多个的CpG位点甲基化（即甲基化状态或水平）并不能反映癌症存在，更不能对癌症进行分类，例如：本专利说明书实施例5（参见图22），虽然其涉及上述130bp之外靶区域的扩增子1-10在患者样品上的测序研究结果，但是这些扩增子或没有提供匹配的正常组织对照样品的测序结果（如扩增子1-6），或未有成功测序的结果（如扩增子7或9，图21-22），或是提供健康全血样品作为对照，但其结果具有明显的高甲基化（如扩增子10，图22），因此实施例5无法表明使用上述扩增子的甲基化水平检测结果能区分癌症患者或健康个体。实施例4（参见图3和4）公开了不论是来自正常个体的样品，还是来自结直肠癌和其它疾病个体的样品，均具有Septin 9 DNA的甲基化。由此可见，本专利单纯的Septin 9基因组或基因序列SEQ ID NO:1-3中的甲基化状态或水平并不能将癌症与健康状况或其他疾病状况区分开，更不能将癌症区分开。
（2）证据2（参见14栏第15行至15栏第19行和图1B和图2）表明同一启动子的CpG岛的不同区域在甲基化状态上可以显著不同。证据3（参见第54页第2段及其译文）表明测序的最显著的结果发现并非所有的CpG位点都等同地甲基化（例如对ICAM-1基因的测序）。因此，对于癌症中的具体CpG的异常甲基化，通常与其所处区域有关，不同CpG位置的甲基化水平以及其与疾病的关系都具有差异。然而，本专利说明书仅仅公开了在SEQ ID NO: 1中特定130bp的区域中的CpG甲基化状态的试验数据，而SEQ IN NO:1-3的区域分别长达20万bp以上、1405bp和2365bp，不能证明除此之外的其他靶区域也能实现预期效果，因此本领域技术人员无法确信Septin 9基因或基因组序列所检测区域之外的CpG甲基化是否能够用于癌症的检测，进而无法确信任何CpG位置的甲基化均能够用作癌症的生物标志物。
对此，合议组认为，
（1）如上所述，虽然本领域公知CpG二核苷酸以不均匀的方式或是分散式分布于3’端编码区，或以集中式（即CpG岛）分布于5’端调控区，并且证据1等也表明CpG位点甲基化广泛存在于正常细胞中，但本专利说明书实施例3以及表16公开了相对于正常的结直肠临近组织，本发明方法选取具有不同的甲基化阈值水平结肠癌细胞样品，至少能够区分结肠直肠癌与正常对照样本之间的甲基化水平存在显著性差异。根据上述记载可以确认本专利技术贡献在于在结直肠组织中发现并证实了Septin 9基因中的CpG甲基化状态或水平与结直肠癌症的关联性，可以对个体中结肠直肠癌进行检测和/或分类。
（2）虽然众多现有技术表明同一基因的不同CpG区域在甲基化状态上可以显著不同，但正如前所述，本专利的技术贡献在于发现在相应的组织样品中Septin 9基因中的CpG甲基化状态或水平与癌症的关联性，而不是寻找CpG甲基化水平的具体标准或具体位置。也就是说，判断所述基因中的CpG甲基化状态或水平，是整体上判断甲基化位点的数量、出现概率等总的变化，并不是特定某一具体位点是否被甲基化，或者该具体位点被甲基化的概率是否提高。如前所述，本专利说明书实施例3以及表16公开了相对于正常的结直肠临近组织，本发明方法至少能够区分结肠直肠癌与正常对照样本之间的甲基化水平，两者之间存在显著性差异，上述结果已证明了该区域在结直肠组织样品的CpG甲基化状态或水平与结直肠癌症相关，据此本领域技术人员已经能够获知并初步建立起Septin 9全长基因组或其部分区域（即SEQ ID NO:1-3）在结直肠组织样品中的CpG甲基化状态或水平与结直肠癌症存在一定的关联性，已经解决了其所要解决的技术问题。
因此，请求人的上述无效请求理由不成立。此外，请求人基于与上述权利要求得不到说明书支持的理由完全相同的理由而进一步认为说明书公开不充分的理由也不成立。
3、关于权利要求4-5、10-11、18-19中涉及“生物样品选自细胞系、组织学切片、组织活检、石蜡包埋的组织、粪便、结肠流出物，及其组合”的技术方案中，其概括的技术特征“肝细胞癌或结肠直肠癌”不合理，导致其保护范围得不到说明书支持的无效理由
一方面，如上所述，在本专利说明书实施例3以及表16公开了相对于正常的结直肠临近组织，本发明方法选取不同的甲基化阈值水平的结肠癌细胞样品，能够区分结肠直肠癌与正常对照样本之间的甲基化水平，因此上述权利要求的技术方案所概括的技术特征“结肠直肠癌”得到说明书的支持，符合专利法第26条第4款的规定。
另一方面，对于上述权利要求中涉及“肝细胞癌”的技术方案，由于本专利说明书实施例并未公开涉及肝癌和正常组织对照样品的检测试验数据，并且没有任何证据证明结肠直肠癌和肝癌具有相同或相似的致癌机理，因此本领域技术人员不能依据本专利公开的检测结肠直肠癌的试验结果来预料该发明同样能用于检测肝癌，致使上述技术方案得不到说明书的支持，不符合专利法第26条第4款的规定。
请求人认为，所述“结直肠癌”涵盖了任何类型和分期的结直肠癌。然而，根据说明书的公开内容，本领域技术人员无法预期：在任何类型和分期的结直肠癌中，Septin 9甲基化均能够在患者的任何样品与非患者的匹配样品之间，具有统计学显著性的差异。
对此，合议组认为，本发明的技术贡献在于发现了Septin 9基因中的CpG甲基化状态或水平与结直肠癌症的关联性，来完成对个体中结肠直肠癌的检测和/或分类。在本专利说明书实施例已经证明结肠直肠癌组织样品与正常对照样本之间的甲基化水平存在显著性差异的情况下，虽然疾病的不同发展阶段中，病变细胞的基因变化可能不完全相同，但因为疾病的延续发展也会使其基因水平的变化紧密关联，本领域技术人员可以根据常规技术手段，来分析本发明具体适用于哪些类型和分期的结直肠癌，这是可以预料得到的。
综上所述，权利要求1-3、权利要求6-9、12-17、20-28得不到说明书的支持，以及权利要求4-5、10-11、18-19中涉及“生物样品选自体液、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液中分离的细胞”和涉及“所述癌症为肝细胞癌”的技术方案得不到说明书的支持，不符合专利法第26条第4款的规定，应予以无效，因此合议组仅针对权利要求4-5、10-11、18-19中“生物样品选自细胞系、组织学切片、组织活检、石蜡包埋的组织、粪便、结肠流出物，及其组合”以及“所述癌症为结肠直肠癌”的技术方案进行如下评述。
（五）关于专利法第26条第3款
专利法第26条第3款规定：说明书应当对发明或者实用新型作出清楚、完整的说明，以所属技术领域的技术人员能够实现为准。
如果本领域技术人员根据说明书的记载，结合所掌握的普通技术知识，能够实施权利要求所保护的技术方案并能合理预期其可以实现预期的技术效果，则即使说明书中存在其他缺陷，也不会导致说明书未充分公开所保护的技术方案。
本案中，权利要求4中涉及“生物样品选自细胞系、组织学切片、组织活检、石蜡包埋的组织、粪便，及其组合”以及“结肠直肠癌”的技术方案，请求保护一种用于确定Septin 9基因或基因组的Septin 9序列的甲基化水平的装置在制备用于检测和/或分类个体中癌症的方法的试剂盒中的用途。
请求人所提出涉及说明书公开不充分的无效理由，除了与上述权利要求得不到说明书支持部分所记载的涉及 “CpG甲基化”、“说明书未给出130bp之外的CpG甲基化的试验数据”的理由相同的理由外，还包括：
（1）说明书实施例3中涉及“NAT/非临近结肠组织”的技术手段无法实施；
（2）说明书实施例4中的样品设计不合理，并且实施例4的结果无法区分癌症个体和非癌症个体；
（3）本专利仅比较了130bp特定区域在结直肠癌组织样品中的甲基化状态，但是针对所述130bp的特定区域的检测试验和结果，并未提供在相应的自身正常组织、健康个体相应组织、非癌患者相应组织的对比试验，因此只能区分正常全血与结肠癌组织，却不能区分结肠癌组织与正常结肠组织。同时，实施例5没有提供任何结果来表明任何一个扩增子（包括SEQ ID NO:3上的扩增子）的甲基化水平在癌症患者与健康个体之间是否存在差异。由于本专利未提供过在匹配样品或群体之间Septin9甲基化状态的比较，基于非匹配样品无法证明Septin 9甲基化标志物与癌症之间必然存在关联，因此无法用于检测结直肠癌。进一步地，针对所述130bp的特定区域的检测试验和结果，不但缺少相应的自身正常组织、健康个体相应组织、非癌患者相应组织的对比试验，同时缺少确定癌患群体的体液（如血浆）与健康个体、其它类型癌症个体、非癌患者个体的相应体液间的对比试验，因此不符合癌症组织特异标志物和液体活检标志物的研发过程和检测标准，不能证明该基因甲基化作为生物标志物能够区分结直肠癌患者和非结直肠癌个体或正常个体（参见证据4-5，附件1-3）。
对此，合议组认为：
（1）关于“说明书实施例3（即说明书第0584段）中涉及“NAT/非临近结肠组织”的技术手段无法实施”的无效理由，根据本专利说明书第0535段/表3以及本案母案申请的国际文本，本领域技术人员能够理解其正确表述应为“NAT/正常的临近组织”，属于说明书撰写瑕疵，并未造成说明书公开不充分；
（2）关于“说明书实施例4中的样品设计不合理，并且该结果无法区分癌症个体与非癌个体”的无效理由，由于本专利实施例2-3分别检测了结直肠癌组织、正常临近组织（相当于阴性对照）、全血以及乳腺癌组织中CpG甲基化水平，表16中的结果显示，对于Septin9（SEQ ID NO：1）的测定7，结直肠癌（CRC）样本与正常对照（NAT）和血液对照相比，CpG甲基化水平呈现出明显的区分度，能够证明本发明的技术方案可以实现从结直肠组织中检测癌症的技术效果，即对于权利要求所请求保护的技术方案而言，说明书中已经充分公开了上述技术方案，请求人的上述理由不成立。
至于实施例4，其仅仅是进一步分析本发明所诊断的目的癌症与其他疾病之间的区分度，在本发明已经证明至少能够实现从结直肠组织中检测结直肠癌症的技术效果的情况下，说明书已经解决了本发明所要解决的基本技术问题，未能充分证明本发明所诊断的目的癌症与其他疾病具有明确的区分度不能证明本专利说明书对于所保护的技术方案未达到充分公开的程度。
根据本专利说明书第0027段和图1的记载，所述Septin9基因存在多个转录本变体，结合双方当事人在口头审理的当庭确认，其中序列SEQ ID NO:1的序列超过22万bp，序列SEQ ID NO: 2是序列SEQ ID NO:1的5’端启动子区，长约1400bp，序列SEQ ID NO:3位于序列SEQ ID NO:1中段的区域，其序列范围从转录本γ的部分启动子区向3’端下游延伸至部分外显子、内含子，直至位于转录本β的上游位点，全长约2300bp。而本发明实施例2-4针对序列SEQ ID NO:1（测定2、测定7）的两个检测试验中（参见表2），其所针对的靶区域同时也位于序列SEQ ID NO:3的内部，共计约130bp的区域。对此，说明书实施例3在样品组1（包括27个血液样品和91个结肠直肠癌样品）中分析了测定2的检测结果，在样品组2（包括26个血液样品，22个结直肠正常临近组织以及81个结直肠癌样品）中分析了测定7的检测结果。虽然该实施例中血液样品组缺少阳性肿瘤患者的血样进行比较，并且因为血液样品的低甲基化水平被作为评价特异性的阴性对照（参见说明书第0650、0553段），但表15-16已经显示相比于结直肠正常临近组织的甲基化水平而言，结直肠肿瘤组织样品呈现明显的高度甲基化水平，即本专利实施例中已经提供了至少一种匹配样本之间甲基化水平的差异。因此，本领域技术人员可以根据这种明显的区分度，能够推断通过检测所述130bp的靶区域的甲基化水平，至少能够获得结直肠组织样品中涉及肿瘤关联度的检测结果。如上所述，在本发明说明书实施例2-3已经初步证明了所述Septin 9基因中的CpG甲基化状态或水平与结直肠癌症组织的关联性的情况下，已经使得本领域技术人员能够确定申请日时该发明具备可行性。
因此，请求人的上述无效理由不成立。此外，请求人基于与该说明书公开不充分的理由而进一步认为权利要求得不到说明书支持的理由也不成立。
综上所述，本专利说明书已经充分公开权利要求权利要求4中涉及“生物样品选自细胞系、组织学切片、组织活检、石蜡包埋的组织、粪便，及其组合”以及“结肠直肠癌”所保护的技术方案，符合专利法第26条第3款的规定。基于相同或相似的理由，本专利说明书也充分公开了权利要求5、10-11、18-19中涉及“生物样品选自细胞系、组织学切片、组织活检、石蜡包埋的组织、粪便、结肠流出物，及其组合”以及“结肠直肠癌”所保护的技术方案，符合专利法第26条第3款的规定。请求人针对上述技术方案的上述无效理由不成立。
（六）关于权利要求6-19、22-24、26不符合专利法实施细则第20条第1款规定的理由
专利法实施细则第20条第1款规定，权利要求书应当说明发明或者实用新型的技术特征，清楚、简要地表述请求保护的范围。
如果本领域技术人员根据权利要求的整体记载能够清楚其所限定的保护范围，则应当认为该权利要求是清楚的。
如上所述，鉴于已得出权利要求6-9、12-17、22-24、26得不到说明书支持以及权利要求18-19中涉及“生物样品选自体液、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液中分离的细胞”和涉及“所述癌症为肝细胞癌”的技术方案得不到说明书，而应当无效的结论，对于上述权利要求和技术方案是否符合专利法实施细则第20条第1款的规定不再予以评述。
对于权利要求10、11、18、19涉及“选自细胞系、组织学切片、组织活检、石蜡包埋的组织、粪便、结肠流出物，及其组合”的技术方案而言，
（1）关于“由此至少部分地提供至少检测和/或分类癌症之一”的表述
本领域技术人员知晓上述表述方式表示该技术方案可以与其他检测和诊断手段相结合，从而作为检测和/或分类癌症的手段之一来获得信息，因此该表述的含义是清楚的。
（2）关于“扩增物的性质以及所述的转化试剂”的表述
根据说明书第0054、0105段段的内容，“扩增物的性质”意在表示根据本发明的技术方案所检测获得的与检测靶标相关的特征，例如扩增物的含量、甲基化水平的均值等，“所述的转化试剂”是包括亚硫酸氢盐在内的能将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶或其他碱基的试剂，因此该表述的含义是清楚的。
（七）关于本专利权利要求1、6-7、20、22-24和28缺少必要技术特征，不符合专利法实施细则第21条第2款的规定
如上所述，鉴于已得出上述权利要求得不到说明书支持而应当无效的结论，对于上述权利要求是否符合专利法实施细则第21条第2款的规定不再予以评述
（八）关于本专利权利要求1、7-19、23-26超出了原母案申请公开的范围，不符合专利法实施细则第43条第1款的规定
如果分案申请的权利要求的修改能够根据原案申请记载的内容直接地、毫无疑义地确定，则其修改没有超出原案申请记载的范围。
鉴于已得出权利要求1、7-9、12-17、23-26以及权利要求10、11、18、19中涉及“生物样品选自体液、尿”和涉及“肝癌”的技术方案得不到说明书支持而应当无效的结论，对于上述权利要求和技术方案是否符合专利法实施细则第43条第1款的规定不再予以评述。
对于权利要求10、11、18、19涉及“生物样品选自细胞系、组织学切片、组织活检、石蜡包埋的组织、粪便、结肠流出物，及其组合”且“癌症选自结肠直肠癌”的技术方案的而言，至于母案（证据6）中未有记载上述权利要求中的技术特征序列SEQ ID NO:4-9，其原因在于原母案表1中序列编号存在错误，所述错误是依据相应的文字描述和具体的序列组成信息能够直接地毫无意义地确定的，即所述SEQ ID NO:4-9应分别对应于SEQ ID NO:1-3的甲基化的或非甲基化的亚硫酸氢盐转化（有义和反义）后的序列，因此该修改并未超出原母案申请公开的范围，因此请求人的上述无效理由不成立。
（九）关于本专利权利要求6、10-11相对于证据25的新颖性
专利法第22条第2款规定：新颖性，是指在申请日以前没有同样的发明或者实用新型在国内外出版物上公开发表过、在国内公开使用过或者以其他方式为公众所知，也没有同样的发明或者实用新型由他人向国务院专利行政部门提出过申请并且记载在申请日以后公布的专利申请文件中。
如果权利要求的技术方案与现有技术公开的内容实质上不相同，则该权利要求的技术方案具备新颖性。
鉴于已得出权利要求6以及权利要求10-11中涉及“生物样品选自体液”和涉及“肝癌”的技术方案得不到说明书支持而应当无效的结论，对于上述权利要求和技术方案是否符合专利法第22条第2款的规定不再予以评述。
本案中，对于引用了权利要求6的权利要求10、11涉及“生物样品选自细胞系、组织学切片、组织活检、石蜡包埋的组织、粪便、结肠流出物，及其组合”且“癌症选自结肠直肠癌”的技术方案，其请求保护区分基因组DNA至少一个靶区域内甲基化和未甲基化CpG二核苷酸的至少一种试剂或成组试剂在制备用于检测和/或分类个体中癌症的方法的试剂盒中的用途，其中所述方法包括使从所述个体生物样品中分离的基因组DNA与所述至少一种试剂或成组试剂接触， 其中所述靶区域等同于或互补于至少一种分别选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3的序列的至少16连续核苷酸的序列，其中所述连续核苷酸包含至少一个CpG二核苷酸序列，由此至少部分地提供对癌症的检测和/或分类，其中所述癌症为肝细胞癌或结肠直肠癌。
请求人认为：上述权利要求的技术方案包括亚硫酸氢盐试剂或甲基化敏感限制酶试剂在制备用于检测和/或分类个体中癌症的方法的试剂盒中的用途，其中所述方法包括使从所述个体生物样品中分离的基因组DNA与所述至少一种试剂或成组试剂接触。证据25（参见第4栏第15-30行，第40栏第15-52行，第24栏第28-45页，第17栏第43-45行，第30栏第5-20行）已经公开了将亚硫酸氢盐试剂制备成用于检测癌症，如结肠直肠癌的试剂盒的用途。证据25（参见第18栏第1段）也已经公开了将甲基化敏感内切酶试剂制备成用于检测癌症，如结肠直肠癌的试剂盒的用途，并公开“含有核酸的样本”包括待实施发明方法的含有核酸的任何类型的材料。核酸可以包含在生物样品中。这些样品包括但不限于任何体液，例如血清，尿液，唾液，血液，脑脊液，胸膜液，腹水，痰液，粪便或组织活检物”。因此，权利要求10、11的上述技术方案相对于证据25不具备新颖性。
专利权人认为：证据25仅仅公开了亚硫酸氢盐试剂，本领域技术人员根据本发明和公知常识能够理解，仅使用亚硫酸氢盐试剂对DNA的靶区域进行处理完全得不到任何能够用于判断的结果。因此，结合本说明书具体表述，本领域技术人员至少还需要针对靶区域具有特异性引物或探针等手段，才能实现这种区分。由于证据25并未公开针对本权利要求中靶区域的上述特异性手段，因此修改的权利要求10、11的上述技术方案相对于证据25具备新颖性。
对此，合议组认为，
发明的保护范围以其权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。如上所述，对于所述试剂在制备用于检测和/或分类个体中癌症的方法的试剂盒的用途，上述权利要求的技术方案进一步限定所述方法包括需要对选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3的内部序列的靶序列的CpG甲基化进行区分，根据本专利说明书第0040、0043、0047-0052段等的记载，“区分”是指使得本领域技术人员通过该试剂的操作，结合所述标志物获得能够对靶区域的甲基化水平或状态的判断结果，因此，为了实施权利要求10、11的上述技术方案，本领域技术人员通常还需要针对靶区域具有特异性的试剂，例如引物或探针等才能完成对肝细胞癌或结肠直肠癌的检测，因此所述试剂的组成以及检测方法，均对制备试剂盒具有限定作用。
证据25公开了将亚硫酸盐试剂用于检测结肠组织的癌基因CACNA1G，从而可检测结直肠癌，并未公开上述Septin9基因（即序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3），也未公开采用了可区分Septin9基因的靶区域甲基化水平的试剂，而亚硫酸盐试剂是广泛作用于核酸的试剂，其本身无法实现区分特定靶区域的功能，因此，权利要求所要保护的技术方案与证据25的技术方案实质上不同，因此，权利要求10、11的上述技术方案相对于证据25具备专利法第22条第2款规定的新颖性，请求人的上述无效理由不成立。
（十）关于创造性
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与申请日以前已有的技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。
确定现有技术是否给出了获得发明技术方案的技术启示不是判断本领域技术人员在现有技术的基础上客观上能否实现发明的技术方案，而是要判断本领域技术人员在现有技术的基础上是否有动机引入区别技术特征对现有技术进行改进以解决其所存在的技术问题。如果本领域技术人员对于引入区别特征是否能够解决发明实际解决的技术问题没有合理的成功预期，则通常不会产生有目的地主动引入相应区别技术特征的动机，此时，发明的技术方案相对于现有技术是非显而易见的。
本案中，权利要求4、5、10、11、18、19中涉及“生物样品选自细胞系、组织学切片、组织活检、石蜡包埋的组织、粪便、结肠流出物，及其组合”以及“所述癌症为结肠直肠癌”的技术方案而言，上述技术方案的引用基础分别是独立权利要求1、独立权利要求6、独立权利要求7。对此，无效请求人认为：
（1）以证据25作为最接近现有技术时，上述技术方案相对于证据25结合证据10（任选的还与证据11、证据12和/或公知常识）、证据25结合证据13或14（任选的还与证据10、证据11、证据12和/或公知常识）不具备创造性；
（2）以证据12作为最接近现有技术时，上述技术方案相对于证据12结合证据10（任选的还与证据11和/或公知常识）、证据12结合证据13或14（任选的还与证据10、证据11和/或公知常识）不具备创造性；
（3）以证据16作为最接近现有技术时，上述技术方案相对于证据16结合证据10或12或13或14（任选的还与证据10、证据12、证据11和/或公知常识）不具备创造性；
对此，合议组认为
1、以证据25作为最接近现有技术
证据25（参见权利要求1）公开了：
“1.一种检测结肠直肠腺瘤或除神经胶质瘤以外的癌症的方法，包括：
a）使来自个体的含有核酸的样品与确定CACNA1G的CpG岛的第一区域和第二区域中的至少一个的甲基化状态的试剂接触，其中第一区域是由SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34扩增的CACNA1G CpG岛的区域，并且其中第二区域是由SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36扩增的CACNA1G CpG岛的区域，和
b）检测第一区域和第二区域中的至少一个的高甲基化，其中与没有结肠直肠腺瘤或神经胶质瘤外的其他癌症的个体中的CACNA1G基因的相同区域相比，第一区域和第二区域中的至少一个的高甲基化指示结肠直肠腺瘤或除神经胶质瘤以外的癌症。”
另外，证据25公开了（参见权利要求5、说明书第18栏第4-20行）样品“包括但不限于任何体液，例如血清，尿液，唾液，血液，脑脊液，胸膜液，腹水，痰液，粪便或活组织检查样品。”“血清，血浆，淋巴细胞，尿液，痰，胆汁，粪便，宫颈组织，唾液，眼泪，脑脊液，区域淋巴结，组织病理学边缘以及排出体腔或器官的任何体液。”
权利要求4中上述技术方案与证据25的区别技术特征在于：检测的基因不同，本专利权利要求限定的是检测Septin9基因，而证据25公开的是检测CACNA1G基因。
证据10公开了对Septin9基因的多个不同剪接变体（转录本α、β、δ、γ和epsilon）在卵巢肿瘤细胞以及其他肿瘤细胞系（宫颈癌、结直肠癌）中的表达情况以及甲基化研究，并定义Septin9为具有改变表达模式的II类癌症基因（参见摘要、译文第4-5页、第8页，图2和图5）。其中，在正常卵巢上皮细胞系（HOSE细胞系）中，α、β、δ、γ和epsilon转录本均正常表达，在卵巢肿瘤细胞或结直肠癌细胞（即PKO、H630细胞）中没有或几乎检测不到β mRNA（参见图2）。同时，证据10（参见译文第8页，图5）公开了通过DNA甲基化抑制剂5-氮胞苷，检测了Septin9各个转录本在卵巢肿瘤细胞系、宫颈癌细胞系和结直肠癌细胞系中的甲基化情况，证明了经过药物处理后，β转录本和γ转录本的表达水平均有明显上升。
然而，一方面，证据10中所采用的脱甲基化试剂5-氮杂胞苷并非特异性针对某个基因进行脱甲基化，即用该试剂处理时，任何一个基因均可发生脱甲基化，本领域技术人员难以确定Septin9的部分剪接变体的表达变化是由其本身的甲基化还是其上游基因的甲基化所影响的，而证据10并未针对Septin9基因区域的甲基化水平进行检测，因此无法证明检测样品中Septin9基因的甲基化状态。另一方面，证据10虽然检测了两种结直肠肿瘤细胞系中Septin9几种剪接变体的水平，但上述测试均缺少结直肠正常组织或细胞作为正常对照，本领域技术人员根据该数据也无法得出这些剪切变体在正常结直肠组织细胞与结直肠肿瘤细胞中存在表达差异，也无法排除5-氮胞苷将正常结直肠组织细胞的甲基化CpG区整体脱甲基化而带来的β转录本水平的表达水平提高。综上，由于不同剪切变体的表达水平在不同肿瘤组织之间差异很大（参见证据10图2，转录本α、δ、epsilon在肿瘤和非肿瘤细胞中均存在表达），并且证据10整体上的研究目的在于确定Septin9基因的剪切变体在卵巢癌中的表达模式差异，其中并未明确提示研究剪切变体的甲基化水平与结直肠癌发生的关联性，因此不足以教导本领域技术人员依据或尝试用Septin9的甲基化水平来诊断结直肠癌。
证据11公开了在DNA样品中探测胞嘧啶甲基化的方法，包括：将包含所研究的DNA和背景DNA的基因组DNA样品以这样一种方式进行化学处理，从而使得所有非甲基化的胞嘧啶碱基都转变为尿嘧啶，而5-甲基胞嘧啶碱基保持不变”（参见权利要求1）；其中，所述化学处理可以用亚硫酸氢盐进行（参见权利要求4）。由此可见，证据11并未涉及结直肠组织中Septin9基因的甲基化水平与癌症的关联性。
证据12（参见摘要第1-5行，译文第1-5页）综述了DNA甲基化(CpG甲基化)标志物能够用于诊断（包括寻找或表征）癌症，包括结直肠癌和肝癌。此外，证据12还公开了所有人类基因中有一半含有CpG岛，通常基因启动子区的CpG岛在正常组织中是未甲基化的，而在患病情况（例如肿瘤形成）时开始甲基化。在一些基因中，特别是那些缺乏CpG岛的基因中，基因体的总甲基化密度与该基因的转录活性相关。和与启动子相关的甲基化相反，CpG位点的下游甲基化通常与转录增加呈正相关（参见译文第1页最后1段至第2页第1段）。即证据12公开了CpG区与癌症发生的相关机理，并给出了如何利用CpG甲基化的标志物来检测相关癌症，但证据12并未涉及Septin9基因，也没有公开或教导在结直肠组织检测Septin9基因的甲基化水平与癌症的关联性。
证据13（参见译文第1页）公开了在人和小鼠肿瘤中观察到Septin9表达改变。在肿瘤细胞中，一些Septin9转录本因甲基化而下调。septin，例如Septin9因改变的表达水平而参与肿瘤形成，因此被视为II类癌基因，因表达改变而影响表型。证据13未涉及结直肠癌，也没有公开或教导在结直肠组织检测Septin9基因的甲基化水平与癌症的关联性。
证据14（参见译文第1页，图2）公开了在人胶质瘤中，存在MLL septin-like fusion（即Septin 9，17q25.3）的异常甲基化。因此，证据14未涉及结直肠癌，也没有公开或教导在结直肠组织检测Septin9基因的甲基化水平与癌症的关联性。
此外，作为公知常识证据的证据3、4、30以及证据14及其补充译文仅证明利用5-氮杂胞苷或5-氮胞苷进行基因的甲基化研究是本领域的常规技术手段，均未公开或教导在结直肠组织检测Septin9基因的甲基化水平与癌症的关联性。
综上所述，本领域技术人员根据证据25、10-14公开的内容以及上述公知常识，难以直接预期结直肠组织中Septin9基因的甲基化水平与结直肠癌症的关联性，缺乏动机想到通过在结直肠组织检测Septin9基因的甲基化水平来诊断结肠癌症，权利要求4的上述技术方案相对于证据25结合证据10（任选的还与证据11、证据12和/或公知常识）、证据25结合证据13或14（任选的还与证据10、证据11、证据12和/或公知常识）具备创造性，符合专利法第22条第3款的规定。基于相同的理由，权利要求5、10、11和18、19的上述技术方案也符合专利法第22条第3款的规定。
2、以证据12作为最接近现有技术
证据12公开了CpG区与癌症发生的相关机理，并给出了如何利用CpG甲基化的标志物来检测相关癌症（参见摘要第1-5行，译文第1-5页，以及译文第1页最后1段至第2页第1段），权利要求4的上述技术方案与之相比的区别特征在于：证据12没有公开或教导在结直肠组织检测Septin9基因的甲基化水平与癌症的关联性。
基于以上分析的证据10、证据11、证据13、证据14以及所述公知常识（例如证据15仅涉及亚硫酸氢钠作为亚硫酸氢钠和焦亚硫酸氢钠的混合物，以及通过甲基化敏感限制酶、扩增酶和针对靶区域特定CpG的引物检测CpG甲基化的方法是本领域的常用的检测甲基化的方法）均未公开或教导在结直肠组织检测Septin9基因的甲基化水平与癌症的关联性，本领域技术人员根据证据12、10-11、13-14公开的内容以及公知常识，难以直接预期结直肠组织中Septin9基因的甲基化水平与结肠癌症的关联性，不会想到通过在结直肠组织检测Septin9基因的甲基化水平来诊断结肠癌症，权利要求4的上述技术方案相对于证据12结合证据10（任选的还与证据11和/或公知常识）、证据12结合证据13或14（任选的还与证据10、证据11和/或公知常识）具备创造性，符合专利法第22条第3款的规定。基于相同的理由，权利要求5、10、11和18、19的上述技术方案也符合专利法第22条第3款的规定。
3、以证据16作为最接近现有技术时
证据16（参见权利要求1）公开了诊断癌症的方法，其包括：a)在第一个体的第一组织类型中确定一种或多种基因的表达，所述基因包含选自表1-50中列出的序列的核酸序列，b)比较来自所述第一个体或第二未受影响个体的第二正常组织类型的所述基因的所述表达，其中所述表达中的差异表明第一个体具有癌症。说明书第3页最后一段中指出，可以被证据16的方法所分类的癌症包括结肠和直肠的癌症。证据16的表44公开了，所述基因可以为小鼠Septin9或人MSF（Septin9）。因此，证据16公开了，利用Septin9基因的表达检测结肠直肠癌的技术方案，二者的区别技术特征在于：证据16检测的是Septin9基因的表达与癌症的关联性，而本专利权利要求4的上述技术方案检测Septin9基因的CpG甲基化标志来确定与结肠直肠癌的关联性。
然而，证据16（参见说明书第3-4页之间段落的译文）具体是检测Septin9基因的表达与淋巴瘤和白血病的关联性，仅仅以穷举所有常见癌症的方式时提到了结肠直肠癌，但并未直接建立Septin9基因与结肠直肠癌的关联性。同时，证据16仅仅将Septin9基因（或MSF）定义为癌症相关基因，并没明确公开其以何种方式与癌症相关，例如属于基因激活或失活、基因表达上调或下调，更未涉及该基因的甲基化。因此，基于证据16的上述教导，本领域技术人员并不能想到进一步分析Septin9基因CpG甲基化水平与结肠直肠癌的关联性。在这种情况下，基于以上分析的证据10、证据11、证据12、证据13、证据14以及所述公知常识均未公开或教导在结直肠组织检测Septin9基因的CpG甲基化水平与癌症的关联性，本领域技术人员结合证据10-14公开的内容以及公知常识，仍然不会想到在结直肠组织检测Septin9基因的CpG甲基化水平与癌症的关联性，从而无法获得权利要求4的上述技术方案，即权利要求4的上述技术方案相对于证据16结合证据10或12或13或14（任选的还与证据10、证据12、证据11和/或公知常识）具备创造性，符合专利法第22条第3款的规定。基于相同的理由，权利要求5、10-11和权利要求18-19的上述技术方案也符合专利法第22条第3款的规定。
请求人认为：
（1）证据10明确教导了Septin9基因的β转录本在肿瘤细胞系（包括卵巢肿瘤细胞系和结直肠癌细胞系RKO）中，表达下调。而经本领域常见的5-氮胞苷处理后，变体β的mRNA表达在肿瘤细胞中显著增加。因此，本领域的技术人员能够获得明确的启示，即Septin9的β转录本在包括卵巢肿瘤和结直肠癌细胞系的肿瘤细胞中，因甲基化而表达下调。
（2）在本领域中（参见证据3、证据4、证据14和证据30），使用5-氮胞苷研究一个具体基因的表达水平与其启动子区甲基化的关系，是一个常用技术手段。事实上，当一个本领域技术人员试图研究一个基因的表达变化是否受到甲基化影响时，其一般会选择使用5-氮胞苷进行处理，并测定药物处理后该基因的表达水平是否恢复。如果恢复表达，则可以得出该基因的表达变化受转录本启动子区域甲基化影响的结论。这一研究过程不受本领域技术人员在5-氮胞苷处理之前是否已经知晓该基因启动子区存在高甲基化的影响。
（3）本专利说明书在Septin9的一个很小特定130bp区域的CpG平均甲基化水平，在结直肠癌细胞和正常全血细胞之间存在差异。由于本领域技术人员无法使用septin9基因及其序列(包括SEQ ID NO:1-3及包含至少一个CpG甲基化的靶区域)的甲基化来解决本发明所要解决技术问题，因此本专利权利要求未取得预料不到的技术效果。
对此，合议组认为：
（1）如上所述，上述两种测试均缺少结直肠组织细胞作为正常对照，其既不能排除剪切变体β在正常结直肠组织细胞同样存在表达下调的情况，也不能排除5-氮胞苷将正常结直肠组织细胞的甲基化CpG区整体脱甲基化而带来的β转录本水平的表达水平提高。由于生物技术诊断领域作为技术快速更新领域的典型代表，本领域技术人员基于现有技术发展的水平通常不会轻易尝试进入未知技术领域，也不会在缺乏成功预期的前提下盲目地进行预测，鉴于不同剪切变体的表达水平在不同肿瘤组织之间差异很大，并且证据10整体上研究Septin9基因的剪切变体在卵巢癌中的表达模式差异，并未明确提示研究剪切变体的甲基化水平与结直肠癌发生的关联性。因此在缺少结直肠组织细胞作为正常对照的情况下，仅仅根据以上两种测试并不能使得本领域技术人员相信Septin9的β转录本在结直肠组织中高表达或正常表达，却在结直肠癌组织中由于发生CpG区甲基化而不表达；
（2）虽然本领域公知5-氮胞苷是研究基因的表达水平与其启动子区甲基化的关系的常用技术手段，但相关证据并不能证明本发明的Septin 9基因的CpG区甲基化水平与癌症的对应关系是仅仅针对Septin 9基因的5’启动子区。相反，本领域公知5-氮胞苷能够将正常结直肠组织细胞的甲基化CpG区整体脱甲基化而带来的β转录本水平的表达水平提高，因此，在缺乏结直肠组织细胞作为正常处理对照，或不清楚本发明的Septin 9基因的CpG区甲基化水平的具体区域的情况下，仅仅根据5-氮胞苷处理结直肠癌细胞导致β变体表达量提高的试验，不足以教导本领域技术人员可以预期剪切变体β在结直肠细胞和肿瘤细胞中存在足以获得诊断结果的明显差异。
（3）如上所述，本专利说明书实施例3以及表16公开了相对于正常的结直肠临近组织，本发明方法至少能够区分结肠直肠癌与正常对照样本之间的甲基化水平存在关联性，即取得了有益技术效果，请求人认为本领域技术人员无法使用septin9基因及其序列的甲基化来解决本发明所要解决技术问题的无效理由不成立。
此外，专利权人提交的反证1-2（包括证据28）用于证明“同一基因上甲基化趋势具有一致性”，反证3（包括证据29）用于证明“septin9基因剪接变体水平与是否发生结直肠癌并无关联”，这与本决定认定的“权利要求1-3、权利要求5-9、11-17、19-28以及权利要求4、10、18中涉及“生物样品选自体液、粪便”和涉及“所述癌症为肝细胞癌”的技术方案得不到说明书的支持”的具体理由无关，合议组不再予以详细评述。
请求人结合证据26所提出的无效理由与与本决定维持维持有效的技术方案无关，合议组也不再予以详细评述。
基于以上事实和理由，本案合议组作出如下审查决定。
三、决定
在专利权人于2019年02月25日提交的权利要求书的基础上，宣告权利要求1-3、权利要求6-9、12-17、20-28以及权利要求4、5、10、11、18、19中涉及“生物样品选自体液、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液中分离的细胞”和涉及“所述癌症为肝细胞癌”的技术方案无效，维持权利要求4、5、10、11、18、19中“生物样品选自细胞系、组织学切片、组织活检、石蜡包埋的组织、粪便、结肠流出物，及其组合”及“所述癌症为结肠直肠癌”的技术方案有效。
当事人对本决定不服的，可以根据专利法第46条第2款的规定，自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。根据该款的规定，一方当事人起诉后，另一方当事人可作为第三人参加诉讼。
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