发明创造名称：一种兰瑞肽的固相合成方法
外观设计名称：
决定号：41165
决定日：2019-07-22
委内编号：4W108672
优先权日：
申请（专利）号：201810137192.9
申请日：2018-02-10
复审请求人：
无效请求人：周红梅
授权公告日：2018-11-13
审定公告日：
专利权人：润辉生物技术（威海）有限公司
主审员：吴文英
合议组组长：魏聪
参审员：孙俊荣
国际分类号：C07K14/655,C07K1/04,C07K1/06,C07K1/14
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点：如果一项权利要求与最接近的现有技术相比虽然存在区别技术特征，但是这些区别技术特征或者被本领域中其他现有技术相应地公开了，或者属于本领域的常规技术手段，那么本领域技术人员有动机在这些现有技术的基础上结合本领域的公知常识得到该项权利要求所请求保护的技术方案，该项权利要求不具备创造性。
全文：
本专利的专利号为201810137192.9，申请日为2018年02月10日，授权公告日为2018年11月13日。本专利授权公告时的权利要求书如下：
“1. 一种兰瑞肽的固相合成方法，其特征在于，包括步骤如下：
1)缩合反应：在缩合体系中，以Fmoc氨基树脂为固相合成的载体，树脂经溶胀、脱去Fmoc保护基和洗涤后，依次从C端至N端缩合连接8个经活化的、含有侧链保护基的Fmoc-氨基酸，得N端氨基含有Fmoc保护基的全保护线性肽树脂Fmoc-D-2-Nal-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Val-Cys(Trt)-Thr(OtBu)-氨基树脂；所述依次缩合的保护氨基酸顺序为：Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-D-2-Nal-OH；所述缩合体系为：A D或A B C，其中A为HOBT或HOAT，B为HATU、HBTU、TBTU或PyBOP其中任何一种，C为DIEA或TMP，D为DIC；
2)加入I2含量为8 eq的1,4-二氧六环溶液，在10～30 ℃条件下反应1～5 h，对步骤1)制得的全保护线性肽树脂进行环化后，分别用四氯化碳和DMF洗涤树脂，得环肽树脂；
3)脱除步骤2)制得的环肽树脂N端D-2-Nal氨基上的Fmoc保护基，得N端氨基裸露的环肽树脂；
4)脱除步骤3)制得的N端氨基裸露的环肽树脂的侧链保护基，并切割树脂，得兰瑞肽粗肽；
5)对步骤4)制得的兰瑞肽粗肽进行纯化、冻干，得兰瑞肽纯品。
2. 根据权利要求1所述的一种兰瑞肽的固相合成方法，其特征在于，步骤1)中所述氨基树脂为：Rink Amide AM树脂、Rink Amide树脂、Rink Amide MBHA树脂或Sieber树脂其中任何一种；所述树脂替代度为0.2～1.4 mmol/g。
3. 根据权利要求1所述的一种兰瑞肽的固相合成方法，其特征在于，步骤3)中脱Fmoc的方法为：加入体积分数为20% PIP-DMF溶液，在10～30 ℃条件下进行两次脱Fmoc保护：第一次脱Fmoc保护和第二次脱Fmoc保护，再用DMF洗涤树脂pH至7；所述第一次脱Fmoc保护反应时间为5 min，所述第二次脱Fmoc保护反应时间为10 min。
4. 根据权利要求1所述的一种兰瑞肽的固相合成方法，其特征在于，步骤4)中，所述切割树脂的方法为：加入裂解试剂，在10～30 ℃条件下反应2～5 h后，抽滤，将滤液加至10倍体积预冷的乙醚中进行沉淀、离心，再用乙醚将沉淀洗涤，真空干燥，得兰瑞肽粗肽。
5. 根据权利要求4所述的一种兰瑞肽的固相合成方法，其特征在于，所述裂解试剂由TFA、TIS、EDT、苯酚和H2O组成的混合溶剂，其中体积份数比为TFA : TIS : EDT :苯酚: H2O = 90 : 2.5 : 2.5 : 2.5 : 2.5。
6. 根据权利要求1所述的一种兰瑞肽的固相合成方法，其特征在于，步骤5)中，所述纯化方法为：采用反相高效液相色潽法对兰瑞肽粗肽进行两步纯化：第一步纯化和第二步纯化；第一步纯化：流动相A相为体积分数0.1% TFA-H2O溶液，流动相B相为体积分数0.1% TFA-ACN溶液；第二步纯化转盐：流动相A相为体积分数0.1%乙酸-H2O溶液，流动相B相为体积分数0.1%乙酸-ACN溶液；所述两步纯化均为梯度洗脱：洗脱时间为60 min，洗脱梯度B相为10%～60%，流速为80 ml/min，紫外检测波长220 nm。
7. 根据权利要求1所述的一种兰瑞肽的固相合成方法，其特征在于，步骤1)中，所述缩合反应具体步骤如下：
a) Fmoc氨基树脂溶胀：向Fmoc氨基树脂中加入DCM，将树脂溶胀0.5 h后，再用DMF洗涤树脂两次；
b) Fmoc氨基树脂脱Fmoc保护：向步骤a)溶胀后的Fmoc氨基树脂中，加入体积分数20% PIP-DMF溶液在10～30 ℃条件下进行两次脱Fmoc保护：第一次脱Fmoc保护和第二次脱Fmoc保护，再用DMF洗涤树脂pH至7；所述第一次脱Fmoc保护反应时间为5 min，所述第二次脱Fmoc保护反应时间为10 min；
c)氨基酸活化：在10～30 ℃条件下，将保护氨基酸和缩合体系混合后活化5 min，得活化氨基酸；
d)缩合反应：将步骤c)制得的活化氨基酸加至步骤b)脱保护的氨基树脂中，在10～30 ℃条件下进行氨基酸的缩合反应1～5 h，得线性全保护肽树脂；
所述保护氨基酸、缩合体系与Fmoc氨基树脂按摩尔质量比为2～5 : 2～5 : 1。”
请求人于2019年03月27日向国家知识产权局提出了无效宣告请求，其理由是权利要求1不符合专利法第26条第4款的规定和权利要求1-7不符合专利法第22条第3款的规定，请求宣告本专利权利要求1-7全部无效，同时提交了如下证据：
证据1：涉案专利授权公告文本；
证据2：公开号为CN1O453O19OA的中国发明专利申请的公开文本，公开日为2015年04月22日；
证据3：公开号为WO2O13098802A2的国际发明专利公开文本，公开日为2013年07月04日，以及第0060-0096段的中文译文；
证据4：授权公告号为CN1OO47527lC的中国发明专利授权公告文本，授权公告日为2009年04月08日；
证据5：杨桂英等，“兰瑞肽的制备”，《中国医药工业杂志》，2013年，第44卷第10期第961-965页；
证据6：公开号为CN1O449713OA的中国发明专利申请公开文本，公开日为2015年04月08日。
请求人认为：（1）本专利说明书实施例仅记载了缩合体系为A D的技术方案，权利要求1中涉及缩合体系为A B C的技术方案得不到说明书的支持，因此权利要求1不符合专利法第26条第4款的规定；（2）证据2公开了基于Fmoc保护基团和Boc保护基团的兰瑞肽的固相合成（参见证据2说明书实施例1），包括先合成Boc-L-Thr-树脂，再合成 H-D-β-Nal-Cys（Acm）-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys（Acm）-Thr-树脂并脱去保护基，随后切割树脂后使线性肽环化，最后纯化、冻干。权利要求1要求保护的技术方案与证据2的区别在于：1）权利要求1对Thr氨基采用的是Fmoc保护基团，证据2公开的是Boc保护基团，在此基础上，导致二者所采用的树脂类型不一样：权利要求1采用的是Fmoc氨基树脂为固相载体，证据2公开的是Merrifield树脂（氯甲基化聚苯乙烯），以及肽的侧链氨基酸的保护基团不完全相同；2）权利要求1与证据2对获得的线性多肽的后处理不同，具体地，权利要求1是对获得的氨基酸线性多肽先进行环化再去N端保护基团，然后进行树脂切割，而证据2公开的是先去N端保护基团，然后进行树脂切割，最后进行环化；3）缩合体系不同，权利要求1使用A＋D或A＋B＋C的缩合体系，其中A为HOBT或HOAT，B为HATU、HBTU、TBTU或PyBOP其中任何一种，C为DIEA或TMP，D为DIC，而证据2使用DIC；4）权利要求1具体限定了环化条件为加入I2含量为8eq的1，4-二氧六环溶液，在10-30℃条件下反应1-5h。根据涉案专利说明书记载的内容可知，通过涉案专利的方法获得的兰瑞肽粗肽纯度为90％，经纯化后总收率为70.3％（参见涉案专利说明书第0051段和0055段），而通过证据2公开的方法，得到纯化后的兰瑞肽纯度为99％，收率达到70％（350／500×100％）（参见证据2说明书第0095段和0097段）。可见涉案专利要求保护的方法在制备兰瑞肽的纯度和收率方面并没有提高。因此，基于上述区别技术特征，确定涉案专利实际解决的技术问题是提供一种兰瑞肽的固相合成方法。对于区别1），证据2公开了Fmoc和Boc可以用于固相多肽合成过程中对α氨基官能团的保护基团，证据3公开了兰瑞肽固相合成中Thr保护基团和Cys、Trp侧链保护基团，且Fmoc和Boc都是常用的保护基团，本领域技术人员据此可以选择相应的保护基团。相应采用Fmoc氨基树脂也是常规的，且证据5中公开了以Rink Amide MBHA为载体进行兰瑞肽的固相合成。对于区别2），已知兰瑞肽需要环化，而对于环化的时机，无论是在获得线性多肽之后就进行环化再进行保护基脱除和切除树脂，还是先将线性多肽上的保护基脱除和切除树脂后再进行环化，其目的都是获得具有生理活性的兰瑞肽。本领域技术人员可以根据实际获得的兰瑞肽产量和实际试验操作难易程度进行选择。另外，证据4公开了先环化然后脱保护并切割树脂的肽固相合成顺序。因此先环化再脱保护和切割树脂为本领域常见的一种肽固相合成中的处理顺序。针对区别3），证据4或5给出了将缩合体系A＋B＋C、A＋D应用到证据2中的技术启示。对于区别4），证据4公开了权利要求1相似的环化条件环化“Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys”，即给出了将过量的I2用于环化的技术启示。对于溶剂，DMF和1,4-二氧六环都是常用的有机溶剂。同时证据5公开了不同的氧化法有不同的反应条件和使用范围，因此选择适合的环化温度也是本领域技术人员通过有限试验可以获得的。由此可见，以上区别技术特征均在现有技术中公开和／或是本领域技术人员的常规选择，并且并未对兰瑞肽的合成带来更好的技术效果。因此在证据2的基础上结合证据3和证据4或5以及本领域内的公知常识获得权利要求1所要求保护的技术方案对于本领域技术人员来说是显而易见的。权利要求1相对于证据2以及证据3、4和5的组合不具有突出的实质性特征，并且相对于证据2也不具有显著的进步。因此，权利要求1不具有专利法第22条第3款规定的创造性。
（2）证据5公开了Rink Amide MBHA为载体进行兰瑞肽的固相合成，而权利要求2中限定的其他树脂都是已经商业化的氨基树脂并用于为固相合成提供载体，相应的替代度是本领域技术人员根据实际需要可以选择的，因此权利要求2也不具备创造性。
（3）证据2中公开了线性肽进行解封闭和脱保护两次约2分钟和5分钟，采用PIP-DMF脱Fmoc保护，相应的参数可常规调整，因此权利要求3也不具备创造性。
（4）证据6公开了采用裂解剂室温下搅拌反应2-2.5h，过滤，滤液加入预冷的乙醚中，搅拌沉淀，沉淀离心弃上清液，沉淀用乙醚洗涤四次后真空干燥，得兰瑞肽直链粗品。同时，证据6公开了裂解剂由TFA、TIS、EDT、苯酚和水组成的混合溶剂，体积分数比可常规调整。因此权利要求4和5也不具备创造性。
（5）证据2公开了采用0.1%乙酸铵/乙腈梯度缓冲液通过色谱柱对兰瑞肽进行提纯，然后用0.25乙酸/乙腈梯度脱盐，证据3公开了采用HPLC对获得兰瑞肽进行提纯：A相为1%TFA-乙腈，B相为1%TFA水溶液，证据6公开了采用反相HPLC制备兰瑞肽精品：泵流速250mL／min，检测波长230nm，流动相A为0．1％TFA溶液，流动相B为甲醇梯度洗脱10％-40％，时间为50min；脱盐：泵流速25OmL／min，检测波长23Onm，A相为纯水，流动相B为甲醇梯度洗脱5％-50％，获得兰瑞肽精品。在此基础上，本领域技术人员有能力通过常规试验获得如权利要求6所述的工艺参数如流动相A和B、流动相和紫外检测波长等。因此，在其引用的权利要求1不具备创造性情况下，权利要求6也不具备创造性。
（6）证据6公开将Rink Amide-AM Resin加入DMF搅拌洗涤5分钟，加入DCM充分溶胀2h，然后加入体积分数为20％的六氢吡啶的DMF溶液，室温下反应20-25分钟，用DMF和DCM交替洗涤六次。将树脂、经过保护的氨基酸和偶联体系（即缩合体系）按1：2-5：8.2-20.5摩尔比进行混合。具体是先将经过保护的氨基酸与缩合体系于DMF中溶解后（即氨基酸的活化）再加入到活化后的树脂混合。室温（落入10-30℃范围之中）反应1小时。对于Fmoc氨基树脂溶胀时间和洗涤次数，本领域技术人员可以根据Fmoc氨基酸的活化情况进行常规调整。对于Fmoc氨基树脂脱氨基保护，参见对权利要求3的评述。对于氨基酸活化温度和时间以及树脂、经过保护的氨基酸和缩合体系的摩尔质量比，本领域技术人员结合采用的缩合体系种类，通过常规试验可以获得合适的工艺参数。因此，在其引用的权利要求1不具备创造性的情况下，权利要求7也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
经形式审查合格，国家知识产权局于2019年04月09日受理了上述无效宣告请求并将无效宣告请求书及证据副本转给了专利权人，同时成立合议组对本案进行审查。
专利权人针对上述无效宣告请求于 2019年05 月08 日提交了意见陈述书，并提交了如下反证;
反证1:授权公告号为CN101357937B的中国发明专利授权公告文本，授权公告日为2012年11月07日；
反证2：授权公告号为CN104650219B的中国发明专利授权公告文本，授权公告日为2017年11月14日；
反证3：授权公告号为CN101555272B的中国发明专利授权公告文本，授权公告日为2012年05月09日；
反证4: 授权公告号为CN104530198B的中国发明专利授权公告文本，授权公告日为2017年09月15日。
专利权人认为：
1）对于权利要求1是否得不到说明书的支持：权利要求9和说明书第56段明确表述了缩合体系A B C的技术方案，且对于本领域技术人员来说，多肽合成反应的机理是相同的，反证1-4也表明在有关多肽类物质的固相合成工艺的专利申请文本中，不需要将权利要求中列举的每一项试剂、化合物结构、反应步骤等在说明书实施例中全部列举，只需说明书中选择其中一个完整的具体的合成步骤，将本专利的方案介绍完整清楚即可，因此权利要求1符合专利法第26条第4款的规定。
2）对于创造性：权利要求1与证据2的区别技术特征为：（1）权利要求1对Thr氨基采用的是Fmoc保护基团，证据2公开的是Boc保护基团，且二者采用的树脂类型以及反应步骤、环化方法不同；（2）二者的合成反应步骤以及对于获得的线性多肽的后处理方法不同；（3）缩合体系不同；（4）本专利解决的技术问题不同：本专利主要是针对现有技术合成方法反应步骤繁琐、反应时间长、溶剂用量大，分离纯化难的技术问题，旨在提供一种经济、环保并且高效的兰瑞肽制备方法。证据3与本专利的反应原理和反应机理都不同，对本专利的技术方案没有结合启示。证据5并未描述每一种氨基酸的侧链是否有保护基，侧链若不保护在反应过程中易产生杂质，导致分离纯化难度增大，产率降低，其公开的是液相体系环化条件，未涉及固相环化。本专利相对于证据4可以大大减少溶剂的消耗，产生的废液少，降低分离纯化的难度，更环保高效。本专利的缩合体系不仅可以有效的抑制氨基酸的消旋，而且可提高缩合效率，使缩合反应步骤简单、反应时间短、溶剂用量少，便于纯化。因此权利要求1相对于现有技术具备创造性。相应的其他权利要求也就具备创造性。
国家知识产权局本案合议组于2019年05月13日将专利权人的上述答复意见及其反证转送给请求人,并于同日向双方当事人发出了口头审理通知书，定于 2019年 07月03 日举行口头审理。
请求人于2019年06月28日提交了针对专利权人意见的答复，认为，1）权利要求9及说明书第56段的文字记载并不能克服权利要求1中缩合体系A B C的技术方案得不到说明书支持的缺陷；反证1-4与权利要求1得不到说明书支持的问题没有关联。2）涉案专利的技术方案是本领域现有技术和/或公知技术的简单堆砌，没有突出的实质性特点。涉案专利说明书记载的“经检测兰瑞肽总收率70.3%”，但没有说明该数据如何得出，因此不能用于说明其具有意料之外的效果。
合议组于2019年07月03日将请求人的上述答复意见转送给专利权人。
口头审理如期举行，双方当事人均委托代理人出席了本次口头审理。在口头审理过程中，双方当事人对合议组成员以及书记员无回避请求，对对方出庭人员的身份资格无异议。在口头审理过程中，合议组对请求人提出的无效宣告请求理由和事实逐一进行了调查，双方当事人充分陈述了各自的意见。口头审理中认定的事实如下：
(1)专利权人对证据1-6的真实性、公开性和关联性以及证据3相关部分译文的准确性均无异议。请求人认可反证1-4的真实性和公开性，但认为其与本专利没有关联性。
(2)专利权人认为本专利说明书第0053段记载的总收率70.3%，是整个方法的收率，不是纯化步骤的收率，具体计算方式是：实际获得的兰瑞肽的重量除以兰瑞肽的分子量后再除以原始的树脂按百分百能偶联的兰瑞肽的摩尔数，最后再乘以100%而得到的。请求人认为说明书中没有说明该数据是如何得出的，是请求人声称的效果，不能用于说明本专利的方法有任何技术进步。
（3）双方确认的无效理由和范围为：权利要求1不符合专利法第26条第4款有关得不到说明书支持的规定；权利要求1-7不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定，证据组合方式：权利要求1相对于证据2、3、4和公知常识的结合或证据2、3、4、5和公知常识的结合；权利要求2的附加技术特征再结合证据5，权利要求3的附加技术特征再结合证据2，权利要求4和5的附加技术特征再结合证据5，权利要求6的附加技术特征再结合证据2或证据3或证据6，权利要求7的附加技术特征再结合证据6。
至此，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
（一）、审查文本
本无效宣告请求审查决定以本专利授权公告的文本为审查基础。
（二）、证据认定
专利权人对证据2-6的真实性、公开性和关联性以及证据3相关部分译文的准确性均无异议，经核实，合议组予以确认。其中证据2-6的公开日都早于本专利的申请日，可以用于评价本专利的创造性。
（三）、专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。
如果一项权利要求与最接近的现有技术相比虽然存在区别技术特征，但是这些区别技术特征或者被本领域中其他现有技术相应地公开了，或者属于本领域的常规技术手段，那么本领域技术人员有动机在这些现有技术的基础上结合本领域的公知常识得到该项权利要求所请求保护的技术方案，该项权利要求不具备创造性。
权利要求1要求保护一种兰瑞肽的固相合成方法，包合缩合反应、环化、脱N端保护基团、脱侧链保护基团并切割树脂、纯化、冻干。
证据2公开了一种兰瑞肽的固相合成方法，包括：以Merrifield 树脂为固相合成的载体，树脂经溶胀、洗涤后从C端缩合连接Boc-L-苏氨酸，合成Boc-L-Thr-树脂；Boc-L-Thr-树脂漂洗解封闭后以缩合剂DIC依次连接7个经活化的Fmoc-氨基酸：Fmoc-L-半胱氨酸(Acm)、Fmoc-L-缬氨酸、Fmoc-L-赖氨酸(Boc)、Fmoc-D-色氨酸、Fmoc-L-酪氨酸(O-t-Bu)、 Fmoc-L-半胱氨酸(Acm)和Boc-D-2-萘丙氨酸,完成的肽链用DCM/TFA/苯甲醚解封闭和脱N端以及lys和Tyr侧链的保护基团，漂洗干燥后得H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-树脂；采用CH3CN和TFA溶液切割树脂获得96%纯度的H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2线性肽。环化所述线性肽获得兰瑞肽粗肽，色谱提纯，冻干获得99%纯度的所需的兰瑞肽。即证据2公开了一种兰瑞肽的固相合成方法，包括先合成Boc-L-Thr-树脂，再合成 H-D-β-Nal-Cys（Acm）-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys（Acm）-Thr-树脂并脱去N端和Lys、Tyr侧链保护基，随后切割树脂后使线性肽环化，最后纯化、冻干。
权利要求1要求保护的技术方案与证据2的区别在于：1）权利要求1对Thr氨基采用的是Fmoc保护基团，证据2公开的是Boc保护基团，相应的，二者所采用的树脂类型不一样：权利要求1采用的是Fmoc氨基树脂为固相载体，证据2公开的是Merrifield树脂（氯甲基化聚苯乙烯），以及肽的侧链氨基酸的保护基团不完全相同；2）权利要求1与证据2对获得的线性多肽的后处理不同，具体地，权利要求1是对获得的氨基酸线性多肽先进行环化再去N端保护基团，然后进行树脂切割，而证据2公开的是先去N端保护基团，然后进行树脂切割，最后进行环化，同时限定了环化条件，即加入I2含量为8eq的1，4-二氧六环溶液，在10-30℃条件下反应1-5h；3）缩合体系不同，权利要求1使用A＋D或A＋B＋C的缩合体系，其中A为HOBT或HOAT，B为HATU、HBTU、TBTU或PyBOP其中任何一种，C为DIEA或TMP，D为DIC，而证据2使用DIC。根据本专利说明书的记载，兰瑞肽总收率70.3%，但是所述总收率是按照实施例1-5的具体方法获得的兰瑞肽纯品的收率，而权利要求1的兰瑞肽合成方法中并没有涉及具体工艺参数，没有证据表明权利要求1的方法均能获得所述的总收率。基于此权利要求1实际解决的技术问题是提供另外一种兰瑞肽的固相合成方法。
对于区别技术特征1），证据2公开了Fmoc和Boc可以用于固相多肽合成过程中对不同氨基酸进行保护，且记载了“偶联氨基酸的α-氨基官能团的这两个标准保护基团为通过利用强酸处理而除去的Boc，以及利用碱除去的Fmoc”、“在通过利用任一种上面提及的α-氨基保护方案的固相方法合成肽的设计中，重要的是在整个链组装期间保护构成氨基酸的任何反应性“侧基”不发生不希望的化学反应。还希望选择来保护各种侧基的化学基团可耐受被用来除去α-氨基保护基团的试剂除去”以及“在Fmoc α-氨基保护方案的情况下，侧基保护官能团应当可耐受用来除去Fmoc的碱性试剂。实际上，在肽链组装之后，这些侧链保护基团一般由温和酸性试剂除去。当利用Boc α-氨基保护方案时，侧链保护基团必须在每一个循环中都可耐受被用来脱保护Boc基团的温和酸试剂除去”（参见证据2说明书第0003和0004段）。即证据2公开了Boc和Fmoc是本领域公知的两个用于保护氨基酸α-氨基官能团的标准保护基团，因此，在证据2的教导下本领域技术人员可以想到对Fmoc和Boc选择使用，如采用Fmoc对D-2-Nal进行保护。
对于Thr保护基团，Cys、Trp和Tyr侧链保护基团，Fmoc和Boc是常用的保护基团，证据3涉及肽和受保护的肽区段的固相合成，其中涉及兰瑞肽的固相合成，包括树脂溶胀、氨基酸活化、偶联，去除Fmoc基团，肽链的伸长，其中公开了兰瑞肽固相合成中各氨基酸的保护基团可选自：Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Cys（Trt）-OH、Fmoc-Trp（Boc）-OH 、Fmoc-Tyr（tBu）-OH（参见证据3说明书第0075、0088和0089段）。保护基团在证据3中所起的作用与其在证据2中所起的作用相同，都是为了在兰瑞肽固相合成中保护氨基酸官能团，避免发生副反应，即证据3给出了将所述保护基团应用到证据2中以替换其中的相关保护基团的技术启示。对于树脂的选择，由于证据2公开了采用Fmoc对多数氨基酸进行保护，本领域技术人员有动机选择Fmoc氨基树脂作为固相载体，并根据Fmoc氨基树脂的性质进行预处理，如脱Fmoc保护基，且证据5涉及兰瑞肽的合成，包括固相合成兰瑞肽线性粗肽后在溶液中环化，公开了固相合成中采用Fmoc保护固相合成策略，以Rink Amide MBHA为载体进行兰瑞肽的固相合成（参见证据5的小结部分），即采用Fmoc氨基树脂为固相合成的载体是本领域的常规选择。
对于区别技术特征2），本领域已知，兰瑞肽是由8个氨基酸残基组成的C端酰胺化的多肽，其在第2位和第7位的半胱氨酸巯基形成二硫键。因此，固相合成的兰瑞肽需要进行环化。而对于环化的时机，无论是在获得线性多肽之后就进行环化再进行保护基脱除和切除树脂，还是先将线性多肽上的保护基脱除和切除树脂后再进行环化，其目的都是使两个半胱氨酸巯基形成二硫键获得具有生理活性的兰瑞肽，而且环化过程与保护基脱去树脂切除是两者相对于独立的过程，并没有证据表明上述过程的顺序不同会对环化或者保护基脱去树脂切除的结果产生不同的技术效果，本领域技术人员可以根据实际情况适当选择先后顺序。另外，证据4涉及具有抑制生长激素释放活性的促生长素抑制素类似物的合成，所述促生长素抑制素类似物与兰瑞肽的作用相同，且都是八个氨基酸组成的环肽，其中公开了所述一系列促生长素抑制素类似物的Fmoc策略装配线性肽序列，包括先环化然后脱保护并切割树脂的肽固相合成顺序（参见证据4说明书第18页第2段以及第20页倒数第一段至第21页第3段）。可见，先环化再脱保护和切割树脂为本领域常见的一种肽固相合成中的处理顺序。至于环化条件，证据4公开了通过在过量的溶于DMF（20ml）的I2（10eq）中反应3小时进行（参见证据4说明书21页第2行）。可见证据4公开了与涉案专利中相似的环化条件。并且证据4中所进行的环化也是使“Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys”链以首尾半胱氨酸成键而环化。也就是说，该特征在证据4中所起的作用与其在涉案专利中所起的作用相同，即证据4给出了将上述区别技术特征应用到证据2中的技术启示。虽然证据4中公开的溶剂为DMF，但是本领域技术人员公知DMF和1，4-二氧六环均是常用的有机溶剂，选择1，4-二氧六环代替DMF不存在任何技术障碍。具体的反应条件（如环化温度等）则是本领域技术人员通过有限的试验可以容易获得的。
针对区别技术特征3），证据4公开了使用取代水平0．54mmol／g的Rink酰胺MBHA树脂，通过手工固相合成法构建肽。所用激活／偶联剂是pyBOP：HOBt：DIEA（4：4：8eq）或HBTU：HOBt：DIEA（4：4：8eq）（相当于权利要求1中的缩合体系A＋B＋C）。偶联和脱保护在DMF中进行。为了偶联半胱氨酸，选择不涉及使用碱基的激活／偶联方法，即溶于DCM/DMF1／1（体积）混合物的DIC：HOBt1：1（mmol）（相当于权利要求1中的缩合体系A＋D）（参见证据4说明书第20页第3段）。证据5公开了采用Fmoc保护固相合成策略，以Rink Amide MBHA为载体，HOBT和DIC为缩合试剂（相当于权利要求1中的缩合体系A＋D）进行兰瑞肽的固相合成（参见证据5小结部分）。并且上述特征在证据4或5中所起的作用与其在涉案专利中所起的作用是相同的，都是为了进行氨基酸的缩合，即证据4或5给出了将上述缩合体系应用到证据2中的技术启示。
综上所述，在证据2的基础上结合证据3-5以及本领域的常规技术手段获得权利要求1的技术方案对于本领域技术人员来说是显而易见的，且也未产生预料不到的技术效果。因此权利要求1不具有专利法第22条第3款规定的创造性。
专利权人认为，1）证据2的反应步骤繁琐、反应时间长、溶剂用量大，分离纯化难，收率低，因此本专利解决的技术问题是提供一种经济、环保且高效的兰瑞肽制备方法。2）证据3虽然采用的是Fmoc策略，但C端Thr是以Fmoc-Thr-NH2的形式接入，树脂使用的是Br-树脂，而本专利是以Fmoc-Thr(OtBu)-OH的形式接入，树脂使用的是氨基树脂，两者反应原理、反应机理都不相同，因此证据3对本专利的技术方案没有结合启示。3）证据5中只描述了Fmoc-氨基酸，并未描述每一种氨基酸的侧链是否有保护基。4）本专利的缩合体系不仅可以有效的抑制氨基酸的消旋，而且可提高缩合效率，使缩合反应步骤简单、反应时间短、溶剂用量少。
对此，合议组认为，1）权利要求1中仅限定了具体的环化步骤的条件，其他仅限定了氨基酸和树脂的保护基团以及缩合试剂，并没有限定缩合、脱保护基、纯化等步骤的具体反应条件，即没有限定具体反应时间、溶剂用量和使用方法等。从中无法看出其与证据2的制备方法在反应步骤、反应时间、溶剂用量上有何实质性区别。对于收率，本专利的兰瑞肽的总收率70.3%是按本专利实施例1-5的具体方法获得的，没有证据表明权利要求1的方法均能获得所述的总收率。2）证据3中已经公开了兰瑞肽固相合成中各氨基酸的保护基团，本领域技术人员为了保护各氨基酸的活性基团，有动机采用证据3中公开的氨基酸保护基团，这与氨基酸和树脂的反应原理、反应机理并无必然联系。3）虽然证据5未公开侧链的保护基团，但证据3中已经公开了侧链的保护基团，给出了相应的技术启示。4）本专利缩合体系中使用的缩合剂都是已知的本领域常用的氨基酸缩合试剂，如碳二亚胺型缩合剂DIC，通常与HOBT或HOAT一起使用来抑制产物消旋，且证据5中也公开了兰瑞肽缩合反应中采用HOBT和DIC与适量溶剂DMF在室温反应，证据4中也公开了HOBT和DIC用于缩合半胱氨酸，反应时间约2小时，本专利缩合反应的步骤、时间和溶剂用量与证据4和证据5的相比并无实质差别。因此专利权人的理由不具有说服力。
2、权利要求2进一步限定权利要求1，限定了树脂的种类和替代度。证据5公开了以Rink Amide MBHA为载体进行兰瑞肽的固相合成（参见证据5小结部分）。该特征在证据5中所起的作用与其在涉案专利中所起的作用相同，均为固相合成提供载体。即证据5给出了将上述特征应用到涉案专利的技术启示。而其他树脂均是已经商业化的氨基树脂并用于为固相合成提供载体。而树脂的替代度为0.2-1.4mmol／g也是本领域技术人员根据实际需要可以选择的。因此，在其引用的权利要求1不具有创造性的情况下，权利要求2也不具有专利法第22条第3款规定的创造性。
3、权利要求3进一步限定权利要求1，进一步限定了步骤3）中脱Fmoc的方法。证据2公开了获得线性肽进行解封闭和脱保护两次约2分钟和25分钟，所用试剂为75：20：5 DCM/TEA/苯甲醚（参见证据2说明书第93段）。此外，证据2还公开了采用哌啶在DMF的溶液解封闭（即采用PIP-DMF脱Fmoc保护），然后用DMF漂洗解封闭的树脂（参见证据2说明书第91段）。因此，在证据2公开内容的教导下，本领域技术人员根据脱保护效果，通过常规试验可以获得合适的各参数。对于将树脂pH值调至7，这是本领域在采用树脂进行固相合成时的常规操作。因此，在其引用的权利要求1不具备创造性的情况下，权利要求3也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
4、权利要求4进一步限定了权利要求1中步骤4）中的切割树脂的方法；权利要求5引用权利要求4，进一步限定了裂解试剂的组成和体积分数比。证据6涉及一种兰瑞肽的制备方法，包括获得二肽片段和六肽肽树脂，缩合获得兰瑞肽树脂，在裂解树脂和去除侧链保护基团时公开了采用裂解试剂室温下（落入10-30℃范围内）搅拌反应2-2.5h（落入2-5h范围内），过滤，滤液加入预冷的乙醚中（即在预冷的乙醚中进行沉淀），搅拌沉淀，沉淀离心弃上清液，沉淀用乙醚洗涤四次后真空干燥，得兰瑞肽直链粗品；所述裂解液为TFA／苯酚/EDT／TIS／H2O，体积比为86：3：3：5：3（参见证据6说明书实施例2）。因此，本领域技术人员在面临脱除兰瑞肽侧链保护基团和将其从树脂上切除的实际需求时，有动机将证据6公开的方法替换证据2公开的方法。抽滤作为过滤一种常见的方式，本领域技术人员也是容易想到选择使用的。所述裂解试剂各组分的体积分数比则是本领域技术人员通过常规实验可以确定的。因此权利要求4和5也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
5、权利要求6进一步限定权利要求1的步骤5）中的纯化步骤。证据2公开了采用0．1乙酸铵／乙腈梯度缓冲液通过色谱柱对兰瑞肽进行提纯，然后用0.25乙酸／乙腈梯度脱盐（参见证据2说明书第97段）。证据3公开了采用HPLC对获得兰瑞肽进行提纯：A相为1％TFA-乙腈，B相为1％TFA水溶液（参见证据3说明书第87段）。证据6公开了采用反向HPLC制备兰瑞肽精品（参见证据6说明书实施例3）：精制：泵流速250mL／min，检测波长230nm，流动相A为0.1％TFA溶液，流动相B为甲醇梯度洗脱10％-40％，时间为50min；脱盐：泵流速25OmL／min，检测波长23Onm，A相为纯水，流动相B为甲醇梯度洗脱5％-50％，获得兰瑞肽精品（参见证据6说明书第109-110段）。在证据2、3和6公开相关参数的基础上，本领域技术人员有能力通过常规试验获得如权利要求6所述的工艺参数如流动相A和B、流动相和紫外检测波长等。因此，在其引用的权利要求1不具备创造性情况下，权利要求6也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
7、权利要求7进一步限定权利要求1中步骤1）中的缩合反应的具体步骤。证据6公开将Rink Amide-AM Resin加入DMF搅拌洗涤5分钟，加入DCM充分溶胀2h，然后加入体积分数为20％的六氢哌啶的DMF溶液，室温下反应20-25分钟，用DMF和DCM交替洗涤六次。将树脂、经过保护的氨基酸和偶联体系（即缩合体系）按1：2-5：8.2-20.5摩尔比进行混合。具体是先将经过保护的氨基酸与缩合体系于DMF中溶解后（即氨基酸的活化）再加入到活化后的树脂混合。室温（落入10-30℃范围之中）反应1小时（落入1-5h范围之中）（参见证据6说明书第22和77-99段）。对于Fmoc氨基树脂溶胀时间和洗涤次数，本领域技术人员可以根据Fmoc氨基酸的活化情况进行常规调整。对于Fmoc氨基树脂脱氨基保护，参见对权利要求3的评述。对于氨基酸活化温度和时间以及树脂、经过保护的氨基酸和缩合体系的摩尔质量比，本领域技术人员结合采用的缩合体系种类，通过常规试验可以获得合适的工艺参数。因此，在其引用的权利要求1不具备创造性的情况下，权利要求7也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
综上所述，权利要求1-7因不符合专利法第22条第3款关于创造性的规定应予无效，由此合议组对于权利要求1不符合专利法第26条第4款的无效理由及相关证据不再予以评述。
基于以上事实和理由，合议组作出如下审查决定。
三、决定
宣告第201810137192.9号发明专利权的权利要求1-7全部无效。
当事人对本决定不服的，可以根据专利法第46条第2款的规定，自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。根据该款的规定，一方当事人起诉后，另一方当事人作为第三人参加诉讼。
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