发明创造名称：合成核酸的方法
外观设计名称：
决定号：41390
决定日：2019-08-14
委内编号：4W108663
优先权日：1999-11-08
申请（专利）号：00818262.0
申请日：2000-03-28
复审请求人：
无效请求人：广州迪澳生物科技有限公司
授权公告日：2008-06-11
审定公告日：
专利权人：荣研化学株式会社
主审员：魏聪
合议组组长：尹昕
参审员：韩世炜
国际分类号：C12N15/10;C12Q1/68
外观设计分类号：
法律依据：专利法第26条第3和4款、专利法第22条第3款
决定要点：如果所属领域技术人员按照说明书记载的内容，不需要创造性的劳动，就能够再现发明的技术方案，解决其技术问题，并且产生预期的技术效果，则说明书满足充分公开的要求。
全文：
本专利的专利号为00818262.0，优先权日为1999年11月08日，申请日为2000年03月28日，授权公告日为2008年06月11日。本专利授权公告时的权利要求书如下：
“1.合成核酸的方法，所述核酸在其一条链上具有交替连接的互补核苷酸序列，所述方法包括：
a）提供核酸的步骤，其3′末端具有能与同一条链上的F1c退火的F1区，并且所述核酸在所述F1区与F1c退火后能形成环，所述环包含能进行碱基配对的F2c区，其中所述核酸是通过下述步骤提供的第二核酸；
i）退火步骤，使第一寡核苷酸与模板F2c区退火，其中该模板的3′末端包括F2c区和位于F2c区5′侧的F1c区，该模板的5′末端包括R1区和位于R1区5′侧的R2区，其中该第一寡核苷酸包括至少两区F2和F1c，F1c与F2的5′侧相连，
F2：具有与F2c区互补的核苷酸序列的区，和
F1c：与模板上F2c区5′侧的F1c区有基本相同核苷酸序列的区，
ii）合成第一核酸的步骤，所述第一核酸具有与所述模板互补的核苷酸序列，此步骤以第一寡核苷酸的F2作为合成的起点，
iii）利用聚合酶催化链置换反应置换ii）步骤中合成的第一核酸，其中与模板中的F2c的3′侧退火的第一外引物用作合成的起点，和
iv）退火步骤，使第二寡核苷酸与步骤iii）所得第一核酸的R2c区退火，其中该第二寡核苷酸包括至少下面的两区R2和R1c，并且R1c与R2的5′侧相连，
R2：3′末端区，其具有与R2c区互补的核苷酸序列，和
R1c：与第一核酸R2c区5′侧的R1c区有基本相同核苷酸序列的区，
接着以所述第二寡核苷酸作为合成的起点，合成第二核酸，并利用聚合酶催化链置换反应置换该第二核酸，其中与模板中的R2c的3′侧退火的第二外引物用作合成的起点；
b）合成步骤，以步骤a）的第二核酸为模板合成其自身的互补链，将已与F1c退火的F1的3′末端为合成起点；
c）退火步骤，使第一寡核苷酸与步骤a）中由第二核酸形成的环中的F2c区退火，接着进行合成步骤，以该第一寡核苷酸为合成起点，通过聚合酶催化链置换型互补链合成反应而进行互补链合成，以置换步骤b）中所合成的互补链；和
d）退火步骤，在步骤c）中被置换的互补链中，使R1c区与同一链3′末端的R1退火，接着进行合成步骤，以所述3′末端为合成起点，通过聚合酶催化链置换型互补链合成反应而进行互补链合成，以置换步骤c）中所合成的互补链，其中合成起点是同一条链3′末端能与R1c区退火的R1区，并且，通过R1c与R1c的退火，形成含有R2c区的环。
2.权利要求1的方法，所述反应中所用的每种寡核苷酸与其在模板中的互补区之间的解链温度在相同严谨条件下存在以下的关系：（外引物/模板3′侧区）≤（F2c/F2及R2c/R2）≤（F1c/F1及R1c/R1）。
3.权利要求1-2中任一项的方法，其中步骤a i）中作为模板的核酸为RNA，且步骤ii）中的第一核酸通过具有反转录酶活性的酶来合成。
4.扩增核酸的方法，所述核酸在其一条链上具有交替连接的互补核苷酸序列，所述方法通过重复以下步骤完成：
A）提供模板的步骤，所述模板在同一链的每个末端区包括能形成环的序列，当这些相互互补的核苷酸序列退火时，在它们之间形成能进行碱基配对的环，其中包含形成环的序列的模板是由下述步骤提供的第二核酸；
i）退火步骤，使第一寡核苷酸与模板F2c区退火，该模板的3′末端包括F2c和位于F2c区5′侧的F1c区，该模板的5′末端包括R1区和位于R1区5′侧的R2区，该第一寡核苷酸包括至少两区F2和F1c，F1c与F2的5′侧相连，
F2：具有与F2c区互补的核苷酸序列的区，和
F1c：与模板上F2c区5′侧的F1c区有基本相同核苷酸序列的区，
ii）合成第一核酸的步骤，所述第一核酸具有与所述模板互补的核苷酸序列，所述步骤以第一寡核苷酸的F2作为合成的起点，
iii）利用聚合酶催化链置换反应置换ii）步骤中合成的第一核酸，其中与模板中的F2c的3′侧退火的第一外引物用作合成的起点，和
iv）退火步骤，使第二寡核苷酸与步骤iii）所得第一核酸的R2c区退火，其中该第二寡核苷酸包括至少下面的两区R2和R1c，并且R1c与R2的5′侧相连，
R2：3′末端区，其具有与R2c区互补的核苷酸序列，和
R1c：与第一核酸R2c区5′侧的R1c区有基本相同核苷酸序列的区，
接着以所述第二寡核苷酸作为合成的起点合成第二核酸，并利用聚合酶催化链置换反应置换该第二核酸，其中与模板中的R2c的3′侧退火的第二外引物用作合成的起点；
B）合成步骤，以步骤A）的第二核酸为模板合成其自身的互补链，以与同一链退火的上述模板的3′末端为合成起点；
C）退火步骤，使第一寡核苷酸与步骤A）形成的环中的F2c区退火，接着进行合成步骤，以该寡核苷酸为合成起点，通过聚合酶催化链置换型互补链合成反应而合成互补链，以置换步骤B）中合成的互补链，使互补链3′末端能进行碱基配对，其中所述寡核苷酸包括与步骤B）中作为合成起点的3′末端互补的核苷酸序列；和
D）退火步骤，使在步骤C）中被置换的互补链3′末端的R1区与该链中的R1c区退火，接着进行合成步骤，以所述3′末端为合成起点，通过聚合酶催化链置换型互补链合成反应而进行互补链合成，以置换步骤C）中所合成的互补链，其中合成起点是同一链3′末端能够与R1c区退火的R1区，并且，通过R1与R1c退火，形成包含能进行碱基配对的R2c区在内的环。
5.权利要求4的方法，进一步包含这样的步骤：步骤A）中的模板是，以步骤C）中的寡核苷酸作为合成起始点所合成的互补链。
6.权利要求4或5的方法，其中链置换型互补链合成反应是在有解链温度调节剂存在的情况下实施的。
7.权利要求6的方法，其中解链温度调节剂为甜菜碱。
8.权利要求7的方法，其中反应溶液中甜菜碱的浓度为0.2-3.0M。
9.合成核酸的试剂盒，所述核酸在其一条链上具有交替连接的互补链，所述互补核苷酸序列包含5′末端F2区和位于该F2区3′侧的F1区、以及5′末端R2区和位于该R2区3′侧的R1区，所述试剂盒包括以下组分：
i）寡核苷酸，其包括至少下面的两区F2和F1c，F1c与F2的5′侧相连，F2：具有与F2c区互补的核苷酸序列的区，和F1c：与F1区互补的区；
ii）寡核苷酸，其包括至少下面的两区R2和R1c，并且R1c与R2的5′侧相连，
R2：3′末端区，其具有与R2c区互补的核苷酸序列，和
R1c：与R1区互补的区；
iii）寡核苷酸，其具有与作为模板的核酸中F2c区3′侧的F3c区互补的核苷酸序列；
iv）催化链置换型互补链合成反应的DNA聚合酶，和
v）核苷酸，其作为组分iv）的底物。
10.权利要求9所述的试剂盒，进一步包含以下组分：
vi）寡核苷酸，其具有与任意R2c区3′侧的R3c区互补的核苷酸序列，所述任意R2c区位于以组分i）所述寡核苷酸作为起点所合成的互补链中。
11.一种用于检测靶核苷酸序列的试剂盒，其中在权利要求9所述试剂盒的基础上，还包含用于检测核酸合成反应产物的检测试剂。”
请求人于2019年03月21日向国家知识产权局提出了无效宣告请求，其理由是本专利说明书不符合专利法第26条第3款的规定，权利要求1-11不符合专利法第22条第3款、第26条第4款的规定，请求宣告本专利权利要求1-11全部无效，同时提交了如下证据：
证据1：“Strand displacement amplification - an isothermal, in vitro DNA amplification technique”，Walker等人，Nucleic Acids Research，1992年第20期，第1691-1696页，及其部分译文，复印件共11页；
证据2：“链置换扩增术（SDA）及其进展”，蒋天伦，国外医学临床生物化学与检验学分册，1999年第20卷第5期，第196-198页，复印件共3页；
证据3：“Detection of Viable Mycobacterium tuberculosis by Reverse Transcriptase-Strand Displacement Amplification of mRNA”，T.J.Hellyer等人，JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY，1999年3月第37期，第518-523页，及其部分译文，复印件共10页；
证据4：“An alternative approach in gene synthesis:use of long selfpriming oligodeoxynucleotides for the construction of double-stranded DNA”，Uhlmann E，Gene，1988年第71期，第29-40页，及其部分译文，复印件共14页；
证据5：专利号为US5595891 A的美国发明专利授权公告文本及其部分译文，授权公告日1997年01月21日，复印件共22页；
证据6：“Betaine and DMSO:Enhancing Agents for PCR”，S.Frackman等人，Promega Notes，1988年第65号，第27-30页，及其部分译文，复印件共6页；
证据7：“核酸扩增技术在结核病诊断中的应用与进展”，唐神结，中华结核和呼吸杂志，1998年09月第21卷第9期，复印件共3页；
证据8：“核酸体外扩增技术诊断骨结核的临床研究”，孙永生等人，中华结核和呼吸杂志，1997年06月第20卷第3期，复印件共4页；
证据9：专利分析报告，复印件共8页。
请求人认为：第一，本专利不符合专利法第26条第3款的规定，理由在于：（1）本专利涉及用于合成核酸的方法，其技术方案是通过引物设计实现单酶、恒温的核酸扩增。但是，根据说明书公开的内容，无论是拟扩增核酸序列还是引物设计都是任意的。所属领域技术人员在未经充分实验的情况下，仅根据本专利的内容无法实现本专利的技术方案，同时由于技术方案的过分不确定也导致无法确定其技术效果。（2）本专利对于目标核酸的长度、反应体系使用的酶、反应温度等均未做限定。（3）说明书中并未给出支持本专利具有高特异性的任何数据，导致对效果公开不充分。（4）证据9证明按照本专利的技术方案，目标序列不能被成功扩增。
第二，本专利不符合专利法第26条第4款的规定，理由在于：（1）权利要求1-11未限定目标核酸的长度、聚合酶的种类或结构，未说明本发明主张的方法所需的反应条件，如反应温度、pH值、各试剂和底物的浓度等；（2）权利要求 8 限定反应溶液中甜菜碱的浓度为 0.2-3.0M，而说明书实施例 3 中甜菜碱浓度增加到 2.0M，则观察不到扩增；（3）权利要求11限定了检测试剂，而说明书实施例中完全没有任何关于检测试剂的使用和数据。
第三，权利要求1-11不符合专利法第22条第3款的规定，理由在于：权利要求1与证据1的区别是权利要求1的引物FA、RA序列系特别设计，使用其可以获得能够与自身退火的延伸产物并提供新的合成起点。为了保留链置换扩增术（以下简称SDA）的优点并克服其缺点，本领域技术人员有动机替换掉SDA技术中的内切酶，采用其他手段为SDA反应体系提供合成起点的方法。结合证据4的教导，本领域技术人员有动机在原先SDA的体系中，通过使用延伸后可以形成发卡结构的引物，为扩增反应提供新的合成起点。本专利的内引物的结构已被证据5公开。在已知 SDA 的缺点（参见证据2）并明确知道改进方向的情况下，结合证据4和证据5的教导，本领域技术人员可知，通过采用含有与靶序列反向重复序列的引物，其延伸产物会形成发卡环结构，该发卡环结构的 3’末端可以为 DNA 聚合酶提供新的合成起点。因此，权利要求 1 相对于证据 1、4、5和公知常识的结合是显而易见的，不具备创造性。在此基础上，权利要求2-11相对于证据1与其它证据及公知常识的结合是显而易见的，不具备创造性。另外，证据2或3公开了与证据1相近的事实，也可以用于评价本专利的创造性。
经形式审查合格，国家知识产权局于2019年04月02日受理了上述无效宣告请求并将无效宣告请求书及证据副本转给了专利权人，同时成立合议组对本案进行审查。
专利权人针对上述无效宣告请求于2019年05月17日提交了意见陈述书以及如下反证：
反证1：“环介导等温扩增技术及其在分子诊断中的应用”，邵军军等人，实用诊断与治疗杂志，2007年第21卷第6期，第450-453页，复印件共4页；
反证2：“环介导等温扩增核酸技术及其应用”，匡燕云，微生物学通报，2007年第34卷第3期，第557-560页，复印件共4页；
反证3：“扩增鸡脂蛋白脂酶基因外显子引物验证与分析”，王敏强，吉林农业大学学报，2007年第29卷第5期，第503-506页，复印件共4页；
反证4：“PCR引物设计及软件使用技巧”，张新宇等人，生物信息学，2004年第4期，第15-18、46页，复印件共5页；
反证5：证据4的补充译文，复印件共4页。
专利权人认为：（1）关于专利法第26条第3、4款：针对合成或扩增核酸的方法，说明书已公开了如何实施相应的步骤，由这些步骤即可合成或扩增核酸，实施例也已提供相应证明；结合本领域的普通知识，通过适当的引物设计，可以通过该方法所包含的步骤来合成或扩增出所需要的核酸，说明书已充分公开了权利要求所主张的反应体系；在实施例2中提供了对合成和扩增产物的分析，其中明确记载“此外还显示没有或很少有非特异性产物”，即已对高特异性进行了验证；反证1、2表明在本专利公开之后很多文献记载了通过重现本专利方法而作出的研究成果，证明本领域技术人员有能力根据本专利说明书公开的内容实现本发明；反证3、4表明本领域技术人员知道如何选择合适的序列片段作为引物及选择适当的反应条件；证据9为请求人单方作出，真实性存疑，以此质疑说明书公开不充分的证据于法无据，且其存在诸多自相矛盾之处，应当不予采纳。说明书已经对权利要求1-11的限定的方法或试剂盒作出了充分的公开，在说明书充分公开的基础上，权利要求1-11限定的范围是适当的，并未超出说明书公开的范围，可以得到说明书的支持。
（2）关于专利法第22条第3款：证据1-3均涉及SDA法，与本专利的方法整体上存在显著差异。虽然两者都使用引物，但引物设计及酶的选择与本专利完全不同，因此两者属于不同的发明构思。此外，SDA法必须使用内切酶，本领域技术人员不可能有动机想到替换内切酶。证据4的单链是自我复制，通过用限制酶去除环结构等方式来形成双链，而不是以引物来复制模板链，在整体上不存在与证据1-3所代表的SDA法结合的启示（参见反证5）。证据5与本专利的方法相比，在反应条件和引物设计等诸多方面存在显著差异，不能提供有关区别技术特征的启示，无法与证据1-3所代表的SDA方法结合。证据6-8仅涉及PCR，与本专利的方法无关。因此，证据1-3难以与证据4或5结合，各权利要求具备创造性。
国家知识产权局本案合议组于2019年05月22日向双方当事人发出了口头审理通知书，定于2019年07月09日举行口头审理，同时将专利权人于2019年05月17日提交的意见陈述书及其反证转送给请求人。
口头审理如期举行，请求人委托的北京中伦律师事务所代理人程芳、公民代理申洪杰、仇真，专利权人委托的北京市磐华律师事务所代理人董巍、谢栒、公民代理张晨、专利权人公司代表砂田亚津子及翻译出席了本次口头审理，双方当事人对对方出庭人员的身份和资格无异议，对合议组成员无回避请求。本案合议组对本无效宣告请求的无效理由和证据逐一进行了调查，双方当事人充分陈述了意见。
在口头审理过程中，请求人当庭提交了证据1-4、7-8的图书馆证明文件，其中记载上述6份证据的公开时间分别为1992年04月11日、1999年09月25日、1999年03月、1988年11月15日、1998年09月12日、1997年06月12日，同时当庭提交了证据9的原件，其上盖有请求人广州迪澳生物科技有限公司印章；专利权人不认可证据1、3、4的真实性和公开时间，认可请求人提交的部分译文的准确性，对于证据4其它部分的译文主张以反证5为准；认可证据2、5、7、8的真实性、合法性以及公开时间，认可证据5的译文准确性；不认可证据6、9的真实性，也不认可证据9的合法性。专利权人当庭提交了反证1-4的图书馆证明文件，请求人认可上述反证的真实性，但均不认可其与本案的关联性。请求人认可反证5中对于证据4其它部分的译文准确性。
专利权人当庭提交了权利要求书的修改替换页（共10项），其中删除了授权公告权利要求书中的原权利要求8，并对剩余权利要求的编号进行了适应性修改。
请求人当庭明确放弃使用证据2和证据3及其相应的证据组合方式，仅主张权利要求1相对于证据1、4、5以及公知常识的结合不具备创造性的无效理由，同时明确其它无效理由与请求书的记载一致。
请求人的证人张影出庭，双方当事人及合议组对相关事实进行了询问，张影明确其独立完成了证据9的专利分析报告及相应的实验；请求人强调该报告用于证明采用本发明的方法无法实现除本案说明书具体实施方式以外的序列的有效扩增；专利权人对张影的身份无异议，认为其学历未经证明，并且强调证据9相应实验设计不严谨。对此，请求人认为，所有PCR反应均采用通用试剂盒，即默认其反应条件应当一致，因此在实验设计时仅替换靶标序列即可，其它方面也均不存在问题。
至此，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
（一）法律适用
本专利的申请日为2000年03月28日，适用1992年09月04日第一次修正的专利法和1992年12月12日第一次修正的专利法实施细则。
（二）审查基础
专利权人于2019年07月09日口头审理当庭提交了权利要求书的修改替换页(共10项)，其中仅删除了授权公告权利要求书中的原权利要求8，并且适应性修改了权利要求的编号；请求人对该修改文本没有异议。经合议组审查，该修改文本的提交时机、修改方式均符合专利法、专利法实施细则以及《专利审查指南》的相关规定。因此，本无效宣告请求审查决定以专利权人2019年07月09日提交的权利要求书以及本专利授权公告文本的其它部分作为审查基础。
（三）关于证据
1、关于证据1-8和反证1-5
证据1、3、4属于外国期刊文献，请求人在提出无效宣告请求时提交了该文献的正文全文复印件及部分中文译文，又于口头审理当庭提交了前述证据的图书馆证明文件，其中包含了相应的出版信息页或者图书馆出具的出版信息；专利权人强调请求人在提出无效宣告请求时并未提交相应的出版信息页或者图书馆出具的出版信息，同时图书馆自身的证明力有限，导致其出具的证明材料亦不足以证明前述证据的真实性和公开时间；合议组经核实前述图书馆证明文件，在没有相反证据的情况下，认可其真实性和公开时间。专利权人认可请求人提交译文的准确性，合议组对此也予以确认。同时，经请求人和专利权人当庭确认，对于证据4的译文，在请求人提交的译文的基础上，专利权人作出补充的部分，以专利权人补充后的译文（即反证5）为准；专利权人没有作出修改或补充的部分，则以请求人提交的译文为准。
证据2、7、8属于国内期刊文献，证据5属于美国专利文献，专利权人认可前述证据的真实性、合法性以及公开时间，合议组对此予以确认。
证据6属于外国期刊文献，请求人仅在提出无效宣告请求时提交了该文献的正文全文复印件及部分中文译文，并未提交原件或者其它证明其真实性的文件，专利权人不认可其真实性和公开时间；在无相关证据证明的情况下，合议组无法确认其真实性。
以上证据1-5、7-8的公开时间均在本专利优先权日1999年11月08日之前，可以作为本专利的现有技术文献用于评判发明创造性。
反证1-4属于国内期刊文献，请求人认可前述反证的真实性，但是强调前述反证的公开时间均在本专利优先权日之前，不属于本专利的现有技术，由此不认可其与本案的关联性。对此，合议组确认前述反证的真实性，同时认为专利权人提供前述反证并非用于证明现有技术的状况，而是为了证明合成核酸领域一直以来的技术水平，因此与本案的技术内容具有关联性。因此合议组认可反证1-4的真实性、合法性和关联性。
2、关于证据9以及证人证言
专利人认为，证据9是由请求人单方提供的实验数据，而并非是由有资质的权威机构出具的实验报告，且其实验设计存在四方面缺陷，一是靶标序列改变后没有相应地改变实验条件，二是引物设计存在明显缺陷，例如其中第一个引物的3’端自身成环，不适合作为引物使用，三是反应时间过短，少于本发明实施例采用的反应时间，四是第一套序列对应的模板序列有误，故有理由怀疑该证据在内容上的客观真实性。
请求人则强调，证据9记载的实验在请求人广州迪澳生物科技有限公司的实验室进行，对其实验步骤有严格要求，且有实验操作者本人在口头审理当庭提供证人证言加以确认，足以保证实验过程和结果的真实性；该实验并非重复本专利说明书的具体实施方式，而只是验证该专利保护的方法是否针对其它靶序列的扩增有效，实验结果显示并不能实现扩增；同类核酸扩增试剂盒通常采用相同的扩增条件，因此不需要改变反应条件。同时，证人在作证时明确实验中采用的引物是由其本人手工设计的。
对此，合议组认为：(1)从形式上看，证据9是用于验证本专利的方法在扩增靶序列方面的效果的实验方案及相应数据，而实验操作者兼证人张影为本案无效请求人的公司员工，与请求人具有利害关系，专利权人对证人作出的实验数据的真实性提出质疑，因此在无其他佐证的情况下，证据9中实验数据的真实性无法确认。
(2)从实体上看，即便考虑证据9的内容，其实验设计也存在瑕疵，导致实验结果无法证明待证事实。
首先，根据本专利说明书的记载，所属领域技术人员可以确定本发明采用特异识别靶标基因序列上六个特异性片段的四条引物以及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在等温条件下进行核酸扩增，并且使链置换DNA的合成不停地自我循环；扩增得以实现的关键在于引物的设计（参见说明书第8页第7行-第15页第16行）。就此而言，生物技术领域公知，引物自身不应存在互补序列，连续互补的碱基通常应该要少于4个，而证据9中针对结核分枝杆菌核酸第2364836-2365068的核酸序列所设计的引物FA-1自身在3’端存在连续5个碱基互补（如下图所示），导致其违背了引物设计的一般原则，容易出现引物自身成环的缺陷，而证人作为相应实验的独立完成者，主张其中的引物均由其本人手工设计，且并未明确上述引物设计缺陷的合理解释，使得所属领域技术人员对于该引物以及采用同样方式设计的其它引物的科学性和有效性产生合理怀疑，直接导致证据9的证明力存疑。
其次，证人主张为了证明本专利保护的技术方案所能获得的技术效果，证据9在实验设计上有意与本专利相一致，即采用了“与本专利授权文本的权利要求6-11及实施例3完全相同的实验条件”；但是在反应时间的选择上却由本专利说明书实施例3的“1小时”缩短为“45分钟”，且证人也未对上述实验设计缺陷给出合理解释，本领域技术人员有理由怀疑其无法扩增的原因系实验设计本身的缺陷所致，而非本发明的技术方案无法实现。
可见，即使考虑证据9的内容，其也不能证明本专利说明书不符合专利法第26条第3款的规定。
（四）关于专利法第26条第3款
专利法第26条第3款规定，说明书应当对发明或者实用新型作出清楚、完整的说明，以所属技术领域的技术人员能够实现为准。
如果所属领域技术人员按照说明书记载的内容，不需要创造性的劳动，就能够再现发明的技术方案，解决其技术问题，并且产生预期的技术效果，则说明书满足充分公开的要求。
1、请求人主张，本专利说明书对于拟扩增核酸序列、引物、靶核酸序列长度、工具酶以及反应温度公开不充分。
对此，合议组认为，根据说明书的记载，本专利的发明目的在于提供一种有效实现核酸等温扩增的方法及其相应的试剂盒。相应的，权利要求1-10保护合成核酸的方法及其试剂盒。
根据说明书公开的信息，本发明的方法是根据靶基因的六个区域设计出四条引物，包括两条内引物和两条外引物，其中内引物由靶序列正义链和反义链的两个特异区域组成，利用核酸链在恒温条件下处于解链和退火的动态平衡状态，在聚合酶的驱动下结合靶序列启动核酸合成，由于内引物同时和双链互补，因此是形成环状结构的主要因素；外引物与内引物前端的序列互补，通过链置换核酸聚合酶的作用置换下内引物合成的核酸链并且合成自身核酸，被置换的链自身形成茎-环结构接着与内引物结合进行扩增和链置换，新合成的茎-环结构的长度是原来的二倍，如此经过滚环扩增之后形成的产物是周而复始的插入靶序列的不同长度的茎-环结构的核酸链，从而实现了靶序列的扩增。
本专利说明书在具体实施方式中验证了利用发明保护的扩增方法能够实现M13mp18核酸结构域、HBV基因序列以及特定靶 mRNA的有效扩增，其循环扩增的过程处于等温状态，由此证明上述方法能够有效实现靶核酸序列的等温扩增（参见本专利说明书第33-42页实施例1-8及图8-10、12-14、16、18）。其中，针对拟扩增核酸序列、引物、靶核酸序列长度、工具酶以及反应温度，相应的实施例（即实施例1、3、7和8）中分别做了例举，并验证了实施的效果。
可见，本发明对于其反应原理进行了清楚的阐释，而且基于上述原理给出了实例以验证了该方法的可行性，从而足以证明其能够特异性扩增目标序列，从而实现后续的检测、诊断等用途（参见本专利说明书第33-42页实施例1-8及图8-10、12-14、16、18）。
根据说明书公开的内容，本领域技术人员能够理解本专利的发明目的不在于扩增某个特定的序列，而是提供一种扩增核酸序列的新方法，因此，采用本发明方法扩增的序列是由本领域技术人员根据其现实需求进行选择的，而拟扩增序列的不同也必然导致相应的引物序列、扩增序列的长度、以及扩增反应具体条件的调整。本专利是在传统核酸扩增技术的基础上进一步开发的核酸扩增方法，所属领域技术人员基于本发明核酸扩增反应的原理，结合本专利给出的实例以及本领域公知的核酸扩增或合成方法（例如，本专利背景技术中介绍的PCR方法及其它常见的核酸合成方法），有能力根据待扩增序列设计相应的引物，选择具有链置换活性的核酸聚合酶以及能够进行常规核酸扩增的反应温度，并通过本专利说明书示例的实验方案加以选择验证。对于靶标序列的长度，本领域技术人员清楚靶标序列过长会导致扩增效率的降低，其长度只要能实现特异性扩增和检测目的即可，本领域技术人员会根据本领域的技术常识、客观条件以及实际需要进行选择，不会也没必要无限制延长靶标序列的长度。可见，说明书已经清楚公开了发明扩增方法的原理和步骤，尽管对于技术效果的公开采用了示例的方式，即以具体实施方案形式提供的实验数据仅涉及特定拟扩增核酸序列、引物序列、靶核酸序列以及Bst DNA聚合酶和5-68.5℃之间的反应温度，但是说明书中记载的上述实验数据已经使得所属领域技术人员确信发明的方法能够实现对靶核酸序列的有效扩增，请求人以此主张本专利不符合专利法第26条第3款规定的理由不成立。
2、请求人还主张，本专利说明书证明所述扩增方法具备高特异性的实验数据的公开不充分。
对此，合议组认为，如前述核酸扩增反应原理的分析，所属领域技术人员可以理解，由于是针对靶序列的六个区域设计的四种特异性引物，六个区域中任何一处与引物不匹配均不能进行核酸扩增，所以本专利保护的扩增方法步骤及其本身的原理机制直接决定了其具备高特异性的特点。
同时，说明书实施例2证明了利用发明保护的扩增方法能够实现M13mp18核酸结构域的有效扩增，并说明了扩增结果“没有或很少有非特异性产物”（参见本专利说明书第35页及图9）；实施例7证明了采用不同的特异性引物，能够选择性扩增M13mp18核酸结构域的野生型模板序列或者突变型模板序列，从而有效检测点突变（参见本专利说明书第40页及图16），上述实验结果都证明了本专利保护的扩增方法具备高特异性。
综上所述，合议组对请求人主张因扩增方法不具备高特异性导致说明书公开不充分的理由不予支持。另外，请求人还依据证据9主张本专利说明书公开不充分。如前所述，证据9中实验数据的真实性无法确认，且证明力存疑，难以证明本发明的技术效果，因此合议组对请求人的所述理由不予支持。
（五）关于专利法第26条第4款
专利法第26条第4款规定，权利要求书应当以说明书为依据，说明要求专利保护的范围。
在判断权利要求是否得到说明书的支持时，应当在所属领域技术人员所掌握的普通技术知识的基础上，结合说明书的全部内容予以考虑，而不是仅考虑说明书具体实施方式的内容。
一般而言，与发明相对于现有技术的改进之处不相关或关联性不大的技术手段通常属于现有技术的范畴，所属领域技术人员容易知晓其替代方式并预见其技术效果。如果说明书中针对该技术手段的公开足以达到使所属领域技术人员能够概括得出并预期到其相应技术效果的程度，则权利要求能够得到说明书的支持。
1、请求人主张本发明权利要求1-10由于未限定靶核酸序列长度、聚合酶种类以及温度、pH、试剂和底物浓度等反应条件而得不到说明书的支持，权利要求10限定了说明书具体实施方案中没有记载的检测试剂，导致该权利要求也得不到说明书的支持。
对此，合议组认为，本专利的发明目的不在于于扩增某个特定的序列，而是提供一种扩增核酸序列的新方法，因此采用本发明方法扩增的序列是由本领域技术人员根据其现实需求进行选择的，而拟扩增序列的不同也必然导致相应的靶核酸序列长度的调整。如前所述，本领域技术人员清楚靶核酸序列过长会导致扩增效率的降低，其长度只要能实现特异性扩增和检测目的即可，完全有能力根据本领域的技术常识、客观条件以及实际需要选择靶序列的合理长度。
对于pH值、各试剂和底物的浓度等反应条件，本专利说明书发明内容部分公开了核酸扩增体系常用的聚合酶、反应物、试剂及其相应的功能活性（参见本专利说明书第18页第1段-第23页第1段）；并且在具体实施方式中列举了采用pH 8.8、特定酶活的Bst DNA聚合酶及其它特定浓度的反应物和试剂的扩增反应体系，能够实现相应核酸的有效扩增（参见本专利说明书实施例1、3、4、7、8）。如前述反应原理的分析，本领域技术人员有能力根据拟扩增序列以及靶标序列的具体情况选择适宜的核酸扩增反应条件（例如，pH值、各试剂和底物的浓度等），并通过本专利说明书示例的实验方案加以选择验证。
对于权利要求10涉及的检测试剂，本专利说明书发明内容部分公开了本发明保护的试剂盒包含“用于检测合成反应产物所必需的介质”，优选“通过利用发光信号或荧光信号可在容器内检测反应产物的系统”，在此基础上还列举了一系列已知用于检测核酸的系统及可能的检测方法（参见本专利说明书第23页第2段-第25页第1段），由此尽管说明书具体实施方案中并未公开检测试剂的内容，所属领域技术人员亦足以依据说明书概述的信息，结合本领域公知的检测核酸产物的技术手段，获得权利要求10保护的试剂盒技术方案，并且能够预期其技术效果。
此外，请求人还主张本发明授权公告的权利要求8中限定的甜菜碱浓度范围过宽，得不到说明书的支持。对此，专利权人在无效程序中删除了该权利要求，该无效宣告请求理由的事实基础已不存在。
综上所述，请求人所提出的本专利权利要求的技术方案无法得到说明书支持的无效理由均不成立，合议组对其不予支持。
（六）关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指同申请日以前已有的技术相比，该发明有突出的实质性特点和显著的进步。
在确定现有技术是否给出了获得发明技术方案的技术启示时，应当考察在未得知发明技术方案的前提下，所属领域技术人员仅基于现有技术的教导是否有动机改进现有技术以获得发明的技术方案，而不是在知晓了发明的技术方案之后，再去考虑基于现有技术进行这种改进的可能性或可行性。如果两篇或多篇现有技术解决的是相同或类似的技术问题，但采取的技术手段存在明显的差异甚至采取了不同的构思，则通常难以将这些现有技术结合从而得到发明的技术方案。
权利要求1要求保护一种合成核酸的方法，所述核酸在其一条链上具有交替连接的互补核苷酸序列，并且限定了该方法所包括的具体步骤以及各步骤的操作方式。结合本发明说明书对于发明原理的相关记载，该方法根据靶基因的六个区域设计出两条内引物FA、RA和两条外引物F3、R3，其中内引物在聚合酶的驱动下结合靶序列启动核酸合成，并形成环状结构，外引物通过链置换核酸聚合酶的作用置换下内引物合成的核酸链并且合成自身核酸，被置换的链自身形成茎-环结构接着与内引物结合进行扩增和链置换，如此经过滚环扩增之后形成的产物周而复始地插入靶序列的不同长度的茎-环结构的核酸链，从而实现了靶序列的扩增，其过程包含了形成扩增循环起始结构（即所谓“哑铃结构”）的起始阶段和扩增循环阶段，具体步骤如下图所示：
请求人主张证据1为最接近的现有技术，其公开了一种等温体外核酸扩增技术——链置换扩增术（SDA）（参见其译文第2页第1段、第5页第1段以及第3页图1、第4页图2），使用了链置换型互补链合成反应的DNA聚合酶exo-klenow、作为DNA聚合酶底物的核苷酸以及两对引物B1、B2和S1、S2，通过引物与原始的模板链退火、延伸和置换而获得可以重复产生的模板链，然后利用SDA反应循环实现模板链的扩增。结合证据1中文译文中两个附图及其附图说明的记载，可以理解该核酸扩增方法实质上是在靶DNA两端连接被化学修饰的限制性核酸内切酶识别序列，核酸内切酶在其识别位点将链DNA打开缺口，DNA聚合酶继之延伸缺口3’端并替换下一条DNA链；被替换下来的DNA单链可与引物结合并被DNA聚合酶延伸成双链，该过程不断反复进行，使靶序列被有效扩增，该扩增方法包含了靶序列生成、SDA反应循环两个阶段。
就权利要求1与证据1的区别而言，请求人主张各种核酸扩增方法都是使用特殊的引物和酶，使得反应中持续产生某一模板，从而实现不断合成核酸的过程，差异实质上仅体现在引物序列设计上的不同，由此认为区别技术特征仅在于权利要求1的引物FA、RA序列系特别设计，使用其可以获得能够与自身退火的延伸产物并提供新的合成起点。
对此，合议组认为，基于前述针对本专利权利要求1保护的方法与证据1公开的SDA方法的基本原理和关键技术手段的分析可知，两者在引物序列的设计、工具酶的选择、用于循环扩增的靶序列的构建、靶序列循环扩增的步骤及其操作方式上均存在显著不同，其中突出体现在：（1）权利要求1方法所使用的四条引物是根据靶基因的六个区域设计出来的，包括两条内引物和两条外引物（即权利要求1的a步骤ii、iii、iv所示内引物FA、RA和外引物F3、R3），其中内引物由靶序列正义链和反义链的两个特异区域组成，外引物与内引物前端的序列互补，而证据1的SDA方法所使用的4条引物需要与靶序列在拟扩增链侧翼的位置结合，且其中两个引物具有Hinc II识别序列，且位于靶互补序列的5’端；（2）权利要求1方法使用核酸聚合酶，而证据1的SDA方法除了链置换型DNA聚合酶以外，还必须用到生成切口的限制酶；（3）权利要求1方法所构建的用于循环扩增的靶序列（即权利要求1的b步骤所示第二核酸序列）具有互补核苷酸序列交替连接的结构，而证据1的SDA方法所构建的用于循环扩增的靶序列（即证据1中文译文第3页图1最后一步所示的核酸序列）在其两端或者一端具有Hinc II识别位点；（4）权利要求1方法所进行的循环扩增是通过链置换核酸聚合酶的作用置换下内引物合成的核酸链并且合成自身核酸，被置换的链自身形成茎-环结构接着与内引物结合进行扩增和链置换（即权利要求1的最后一个合成步骤示意图），而证据1的SDA方法所进行的循环扩增是核酸内切酶在其识别位点将链DNA打开缺口，DNA聚合酶继之延伸缺口3’端并替换下一条DNA链，被替换下来的DNA单链再与引物结合并被DNA聚合酶延伸成双链。
如前所述，根据本专利说明书的记载，利用所保护的扩增方法实现了M13mp18核酸结构域、HBV基因序列以及特定靶 mRNA的有效扩增，其循环扩增的过程处于等温状态，证明上述方法能够有效实现靶核酸序列的等温扩增（参见本专利说明书第33-42页及图8-10、12-14、16、18）。可见，权利要求1的技术方案实际解决的技术问题是提供一种有效实现核酸等温扩增的方法。
证据4公开了一种用长自启动寡脱氧核苷酸构建双链DNA的方法（参见其译文第1页最后一段及图1以及反证5第2页图1、第3页图7），其使用在3’端具有短反向重复的寡核苷酸，形成发夹结构，然后以这种发夹的3’端作为DNA聚合酶I催化的第二DNA链合成的引物，通过用限制酶消化实现环结构的去除以及用于后续克隆的粘性末端的生成，由此合成了几种寡核苷酸和基因片段。
证据5公开了一种生产单链多脱氧核苷酸的方法（参见其译文第1页摘要部分、第2页最后一段及图1），所述单链多核苷酸具有两个非连续且彼此互补的区段，所述方法包括以下步骤：（a）以组合提供（1）具有两个非连续、非互补核苷酸序列S1和S2的多核苷酸，其中S2在S1的5’端，并且长度至少为10个脱氧核苷酸，和（2）由两个脱氧核苷酸序列组成的延伸探针，其中所述延伸探针的3’端处的序列可与S1杂交且另一个所述脱氧核苷酸序列与S2同源，以及（b）沿所述多核苷酸延伸所述延伸探针。
请求人主张基于本领域公知的SDA技术（即证据1）存在的缺陷（参见证据2），有动机替换其内切酶；基于证据4的教导，有动机通过使用延伸后可以形成发卡结构的引物，为扩增反应提供新的合成起点；基于证据5的教导，有动机设计含有与靶序列反向重复的序列的引物，作为扩增反应的新的合成起点，由此容易获得权利要求1的技术方案。
对此，合议组认为，证据1、4、5分别公开了不同的核酸合成方法，这些方法是基于各自的构思采用不同的技术手段而形成的独立技术方案，且各自的核心技术手段是实现各自扩增效果的必要条件，具体分析如下：
首先，证据1的关键在于使靶DNA两端连接上被化学修饰的限制性核酸内切酶识别序列，核酸内切酶在其识别位点将链DNA打开缺口，DNA聚合酶继之延伸缺口3’端并替换下一条DNA链，再利用引物和DNA聚合酶将被替换下来的DNA单链延伸成双链，以便开始下一个扩增循环，其中限制性核酸内切酶及其识别序列是完成扩增循环所必须的，也是该技术方案（SDA技术）的核心技术手段；证据2中虽然提到证据1所述SDA技术的不足，但是也明确这是由SDA技术自身的工艺特点所决定的，同时并未教导或暗示克服其不足的任何方式或手段，可见所属领域技术人员没有理由替换或者放弃限制性核酸内切酶及其识别序列。
其次，证据4中使用的3’端具有短反向重复的寡核苷酸实质上是一种自我复制的单链寡脱氧核苷酸，该技术的关键在于先利用单链寡脱氧核苷酸自我复制，再利用限制酶去除环结构来形成双链，同时还生成粘性末端以便于后续扩增反应。可见，在3’端具有短反向重复的寡核苷酸并不是复制模板链所用的引物，不仅与证据1的核酸扩增方式有显著差异，而且也无法给出将这样的具有短反向重复的寡核苷酸用作引物复制模板链的技术启示，因此所属领域技术人员没有动机将类似技术手段应用于证据1的技术方案。
再次，证据5仅公开了具有两个非连续且彼此互补区段的单链多脱氧核苷酸的合成方法，并未公开与证据1的核酸扩增方式之间的联系，所属领域技术人员没有动机将这样的单链多脱氧核苷酸作为引物用于证据1的技术方案。
综上所述，证据4、5均未公开本专利权利要求1与证据1的区别技术特征，也未给出将上述区别技术特征应用于证据1的技术启示，所属领域技术人员难以想到将证据4和5中公开的技术手段应用于证据1所述的SDA技术，更难以想到对证据1的核心技术手段加以改进；同时，证据4和5均未涉及核酸等温扩增的信息，且根据其原理分析，证据4的扩增方法涉及两种不同类型酶的生物学作用，这两类酶各自适宜的反应温度通常会有差异，证据5的扩增方法涉及杂交、延伸、解离各步骤的循环，也需要反应温度的改变，而本专利的扩增方法中利用核酸链在恒温条件下处于解链和退火的动态平衡状态，实现了等温状态下的核酸扩增，相应的，说明书具体实施方式中显示本发明仅在形成扩增循环起始结构（即“哑铃结构”）的起始阶段存在温度的改变，而在扩增循环阶段则保持等温状态，由此证明了该扩增方法能够实现多种核酸靶序列的等温扩增。现实中该方法对应的“LAMP技术”自2000年出现以来以其快速、精确、高效、低成本的特性被广泛应用，已发展为商业化的检测试剂盒，用于细菌和病毒的检测，有利于在发展中国家的基层实验室，尤其是传染病比较严重的地区应用。因此本专利权利要求1相对于证据1和证据4、证据5以及公知常识的结合而言具有创造性，符合专利法第22条第3款的规定。
请求人针对从属权利要求2-7的创造性评述中，还使用了证据3。对于该证据，合议组认为，证据3公开了SDA技术的一种具体应用，即采用链置换扩增mRNA技术检测活结核分枝杆菌（参见其译文第1页摘要），请求人使用该证据是为了证明从属权利要求中限定的具体解链温度调节剂属于现有技术，该证据均未公开本专利权利要求1与证据1的区别技术特征，也未给出将上述区别技术特征应用于证据1的技术启示，因此在考虑证据3的基础上，本专利权利要求1仍然具有创造性，符合专利法第22条第3款的规定。
从属权利要求2-7引用了权利要求1，相对于上述证据的结合而言也具有创造性，符合专利法第22条第3款的规定。
权利要求8保护合成核酸的试剂盒，并且限定了核酸的序列结构特征以及试剂盒中引物的序列结构特征、聚合酶的种类以及底物组分。由前述分析可知，该权利要求所限定的核酸的序列结构特征以及试剂盒中引物的序列结构特征、聚合酶的种类均构成了与证据1的区别，基于权利要求1类似的理由，该权利要求也具有创造性，符合专利法第22条第3款的规定。权利要求9-10引用了权利要求8，相对于上述证据的结合而言也具有创造性，符合专利法第22条第3款的规定。
基于以上事实和理由，本案合议组作出如下审查决定。
三、决定
在专利权人于2019年07月09日提交的权利要求1-10的基础上，维持第00818262.0号发明专利权有效。
当事人对本决定不服的，可以根据专利法第46条第2款的规定，自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。根据该款的规定，一方当事人起诉后，另一方当事人可以作为第三人参加诉讼。
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