发明创造名称：合成多核苷酸的方法
外观设计名称：
决定号：41523
决定日：2019-08-25
委内编号：4W108660
优先权日：2000-09-19
申请（专利）号：01819083.9
申请日：2001-09-19
复审请求人：
无效请求人：广州迪澳生物科技有限公司
授权公告日：2005-10-12
审定公告日：
专利权人：荣研化学株式会社
主审员：魏聪
合议组组长：尹昕
参审员：韩世炜
国际分类号：C12N15/10;C12Q1/68
外观设计分类号：
法律依据：专利法第26条第3、4款、专利法第22条第3款
决定要点：如果所属领域技术人员按照说明书记载的内容，不需要创造性的劳动，就能够再现发明的技术方案，解决其技术问题，并且产生预期的技术效果，则说明书满足充分公开的要求。
全文：
本专利的专利号为01819083.9，优先权日为2000年09月19日，申请日为2001年09月19日，授权公告日为2005年10月12日。本专利授权公告时的权利要求书如下：
“1. 合成多核苷酸的方法，其含有下列步骤：混合下列组分（1）至（5），并在允许使用（4）中的 DNA 聚合酶进行依赖于模板的互补链合成的条件下进行保温：
（1）：模板多核苷酸，其：
（a）具有含有至少一套互补核苷酸序列的靶核苷酸序列，
（b）当（a）中的互补核苷酸序列杂交时即形成能碱基配对的环，
（c）通过使其 3’-末端与其自身退火而形成环，和
（d）与其自身退火的 3’-末端可成为使用其自身为模板的互补链合成的起点；
（2）：至少两种引物，所述引物可在模板多核苷酸环上的不同位置处提供互补链合成起点；
（3）：至少一种引物，所述引物可在环中与 2 中所述的引物不同的位置处提供互补链合成起点，所述环是通过模板多核苷酸和/或使 2 中所述的引物与模板多核苷酸退火而产生的延伸产物形成的；
（4）：催化伴随着链置换的互补链合成的 DNA 聚合酶；和
（5）：互补链合成的底物。
2. 权利要求 1 的方法，其中所述模板多核苷酸在其 5’-末端具有与其自身核苷酸序列的任意区域互补的核苷酸序列。
3. 权利要求 2 的方法，其中所述模板多核苷酸是通过下列步骤产生的：
a）退火第一引物与靶核苷酸序列，并使用其作为起点进行互补链合成反应，其中所述第一引物(i)可在 3’-末端为限定构成靶核苷酸序列一条链的 3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其 5’-方向具有与使用该引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列；
b）将步骤 a）中合成的第一引物延伸产物中与第二引物退火的区域置于允许碱基配对的条件下，其中所述第二引物(i)在其 3’-末端具有核苷酸序列，该序列能为限定使用第一引物为起点的延伸产物中的靶核苷酸序列 3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其 5’-方向具有与使用该引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列；
c）使所述第二引物与步骤 b）中可形成碱基配对的区域退火，并使用其作为起点进行互补链合成；和
d）使步骤 c）中合成的第二引物延伸产物的 3’-末端与其自身退火，并使用其自身作为模板进行互补链合成。
4. 权利要求 3 的方法，其中两种引物是第一引物和第二引物，至少一种引物是环引物，它可在第一引物或第二引物延伸产物中的得自每种引物的区域与和每种引物有关的上述任意区域之间提供互补链合成起点。
5. 权利要求 4 的方法，其中所述环引物是(i)第一环引物，它可在第一引物延伸产物中的得自第一引物的区域与和第一引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点，和(ii)第二环引物，它可在第二引物延伸产物中的得自第二引物的区域与和第二引物有关的上述任意区域之间提供互补链合成起点。
6. 权利要求 4 的方法，其中所述环引物在其 5’-末端进一步含有与上述任意区域互补的核苷酸序列。
7. 权利要求 3 的方法，其中通过自外部引物起的互补链合成来置换第一引物和/或第二引物的延伸产物，使第一引物或第二引物的每种产物转变为单链，所述外部引物可为步骤 b）和/或步骤 c）中的与第一引物或第二引物有关的模板的 3’-方向提供互补链合成起点。
8. 权利要求 3 的方法，其中步骤 a）中的靶核苷酸序列以双链多核苷酸的形式存在，通过使用任意引物为起点的互补链合成反应，使与第一引物退火的区域形成碱基对键。
9. 权利要求 8 的方法，其中在解链温度调节剂的存在下进行步骤 a）。
10. 权利要求 9 的方法，其中解链温度调节剂是选自下列的至少一种化合物：甜菜碱、脯氨酸、二甲基亚砜和三甲胺 N-氧化物。
11. 扩增模板多核苷酸的方法，其包括下列步骤：根据权利要求 1 或 5 的方法，使用模板多核苷酸作为模板重复进行互补链合成，并根据权利要求 1 或 5 的方法，使用合成反应产生的延伸产物作为新的模板多核苷酸，进行另一个多核苷酸合成反应。
12. 检测样品中的靶核苷酸序列的方法，其包括下列步骤：进行权利要求 11 的扩增方法，并将扩增反应产物的产生与靶核苷酸序列的存在相联系。
13. 权利要求 12 的方法，其中在多核苷酸检测试剂的存在下进行权利要求 11 的方法，根据检测试剂的信号变化观察是否产生扩增反应产物。
14. 根据权利要求 12 的检测方法检测靶核苷酸序列中的突变的方法，所述方法包括下列步骤：(i)当靶核苷酸序列不是预测的核苷酸序列时，阻断至少一个选自构成上述扩增法的互补链合成反应的互补链合成反应，和(ii)观察对扩增反应的抑制作用。
15. 权利要求 14 的方法，其使用了下列第一引物和第二引物，其中至少第一引物或第二引物在其 5’-方向含有检验序列，
其中，检验序列指的是一种核苷酸序列，其中(i)当构成特定区域的核苷酸序列不是预测的核苷酸序列时，使用检验序列作为模板合成的互补链的 3’-末端与靶核苷酸序列或其互补链退火时会发生错配，和(ii)此错配会抑制通过使用 3’-末端作为起点而起始的互补链合成反应，
第一引物(i)可在其 3’-末端为限定构成靶核苷酸序列一条链的 3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其 5’-方向具有与使用该引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列，和
第二引物(i)在其 3’-末端具有核苷酸序列，该序列能为限定使用第一引物为起点的延伸产物中的靶核苷酸序列 3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其 5’-方向具有与使用该引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列。
16. 权利要求 15 的方法，其中当构成特定区域的核苷酸序列不是预测的核苷酸序列时，使用检验序列作为模板合成的互补链与靶核苷酸序列或其互补链退火时，在自互补链 3’-末端起的第 2 至第 4 个核苷酸处会发生错配。
17. 权利要求 15 的方法，其使用下列第一环引物和/或第二环引物作为环引物；需满足的条件是：当环引物在其 5’-方向含有与引物 5’-方向上安排的任意区域互补的核苷酸时，或当引物 5’-方向上安排的核苷酸序列是检验序列对，需在环引物的 5’-方向上安排序列，该序列中用于提供检验序列中的错配的核苷酸不同于检验序列：
第一环引物：它可在第一引物延伸产物中的得自第一引物的区域与和第一引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点；
第二环引物：它可在第二引物延伸产物中的得自第二引物的区域与和第二引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点。
18. 权利要求 17 的方法，其中当构成上述特定区域的核苷酸序列不是预测的核苷酸序列时，使用检验序列作为模板合成的互补链与靶核苷酸序列或其互补链退火时，在自该互补链 3’-末端起的第 2 至第 4 个核苷酸处会发生错配，其中第一环引物和/或第二环引物的5’-方向上安排的核苷酸序列与导致检验序列中的错配的核苷酸有所不同。
19. 用于扩增靶核苷酸序列的试剂盒，其含有：
a）第一引物(i)可在其 3’-末端为限定构成靶核苷酸序列一条链的 3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其 5’-方向具有与使用该引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列；
b）第二引物(i)在其 3’-末端具有核苷酸序列，该序列能为限定使用第一引物为起点的延伸产物中的靶核苷酸序列 3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其 5’-方向具有与使用该引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列；
c）第一环引物，它可在第一引物延伸产物中的得自第一引物的区域与和第一引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点；
d）第二环引物，它可在第二引物延伸产物中的得自第二引物的区域与和第二引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点；
e）催化伴随着链置换的互补链合成的 DNA 聚合酶；和
f）互补链合成的底物。
20. 权利要求 19 的试剂盒，其进一步含有：
g）外部引物，它可为第一引物和/或第二引物的模板的 3’-方向提供互补链合成起点。
21. 权利要求 19 的试剂盒，其中第一引物和/或第二引物在其 5’-方向上含有检验序列。
22. 权利要求 19 的试剂盒，其含有下列第一环引物和/或第二环引物作为环引物；需满足的条件是：当环引物在其 5’-方向含有与引物 5’-方向上安排的任意区域互补的核苷酸序列时，或当引物 5’-方向上安排的核苷酸序列是检验序列时，用于提供检验序列中的错配的核苷酸在环引物的 5’-方向上安排不同于检验序列的序列：
第一环引物：它可在第一引物延伸产物中的得自第一引物的区域与和第一引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点；和
第二环引物：它可在第二引物延伸产物中的得自第二引物的区域与和第二引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点。
23. 扩增多核苷酸的方法，其含有下列步骤：混合下列组分 a）至 g），并在能进行伴随着链置换的互补链合成反应的条件下保温：
a）第一引物(i)可在其 3’-末端为限定构成靶核苷酸序列一条链的 3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其 5’-方向具有与使用该引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列；
b）第二引物(i)在其 3’-末端具有核苷酸序列，该序列能为限定使用第一引物为起点的延伸产物中的靶核苷酸序列 3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其 5’-方向具有与使用该引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列；
c）第一环引物，它可在第一引物延伸产物中的得自第一引物的区域与和第一引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点；
d）第二环引物，它可在第二引物延伸产物中的得自第二引物的区域与和第二引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点；
e）催化伴随着链置换的互补链合成的 DNA 聚合酶；和
f）互补链合成的底物；和
g）含有靶核苷酸序列的受试多核苷酸。
24. 权利要求 23 的方法，其进一步含有：
h）外部引物，它可为模板的 3’-方向提供互补链合成起点，所述模板与其中第一引物和/或第二引物的 3’-末端与靶核苷酸序列退火的区域有关。
25. 测定靶核苷酸序列中的特定核苷酸是否为第一核苷酸或第二核苷酸的方法，其包括下列步骤：混合下列组分 a）至 d），并在能进行伴随着链置换的互补链合成反应的条件下保温，通过选自下列的 a）中的任一个引物套测定扩增产物的形成速率和/或形成的量：
a）
（1）：第一核苷酸内部引物对和第一核苷酸环引物对
（2）：第一核苷酸内部引物对和第二核苷酸环引物对
（3）：第二核苷酸内部引物对和第一核苷酸环引物对，和
（4）：第二核苷酸内部引物对和第二核苷酸环引物对；
其中，第一核苷酸内部引物对和第二核苷酸内部引物对都是由下一个第一内部引物和第二内部引物组成的引物对，在第一核苷酸引物对中，当靶核苷酸序列中的特定核苷酸是第一核苷酸时，将使用以第一内部引物和第二内部引物的 5’-方向为模板而合成的互补链的 3’-末端用作起点的互补链合成反应不受抑制，但是，当所述特定的核苷酸是第二核苷酸时，所述反应会受抑制；
在第二核苷酸内部引物对中，当靶核苷酸序列中的特定核苷酸是第二核苷酸时，将使用以第一内部引物和第二内部引物的 5’-方向为模板而合成的互补链的3’-末端用作起点的互补链合成反应不受抑制，但是，当所述特定的核苷酸是第一核苷酸时，所述反应会受抑制；
第一内部引物(i)可在其 3’-末端为限定构成靶核苷酸序列一条链的 3’-方向的区域提供互补链合成起点，和(ii)在其 5’-方向具有与使用该内部引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列；
第二内部引物(i)在其 3’-末端具有核苷酸序列，该序列能为限定使用第一内部引物为起点的延伸产物中的靶核苷酸序列 3’-方向的区域提供互补链合成起点， 和(ii)在其 5’-方向具有与使用该内部引物作为起点的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列；
第一核苷酸环引物对和第二核苷酸环引物对都是由下一个第一环引物和第二环引物组成的环引物对，在第一核苷酸环引物对中，当靶核苷酸序列中的特定核苷酸是第一核苷酸时，将使用以第一环引物和第二环引物的 5’-方向为模板而合成的互补链的 3’-末端用作起点的互补链合成反应不受抑制，但是，当所述特定的核苷酸是第二核苷酸时，所述反应会受抑制；
在第二核苷酸环引物对中，当靶核苷酸序列中的特定核苷酸是第二核苷酸时，将使用以第一环引物和第二环引物的 5’-方向为模板而合成的互补链的 3’-末端用作起点的互补链合成反应不受抑制，但是，当所述特定的核苷酸是第一核苷酸时，所述反应会受抑制；
第一环引物，它可在第一内部引物延伸产物中的得自第一内部引物的区域与和第一内部引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点；和
第二环引物，它可在第二内部引物延伸产物中的得自第二内部引物的区域与和第二内部引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点；
b）催化伴随着链置换的互补链合成的 DNA 聚合酶；
c）互补链合成的底物；和
d）含有靶核苷酸序列的受试多核苷酸。
26.权利要求 25 的方法，其进一步含有：
e）外部引物，它可为模板的 3’-方向提供互补链合成起点，所述模板与其中第一引物和/或第二引物的 3’-末端与靶核苷酸序列退火的区域有关。”
请求人于2019年03月21日向国家知识产权局提出了无效宣告请求，其理由是本专利说明书不符合专利法第26条第3款的规定；权利要求1-26不符合专利法第22条第3款以及第26条第4款关于权利要求应该得到说明书支持的规定；权利要求4-6、17-26不符合专利法第26条第4款关于权利要求应该清楚的规定，请求宣告本专利权利要求1-26全部无效，同时提交了如下证据：
证据1：“Loop-mediated isothermal amplification of DNA”，T. Notomi等人，Nucleic Acids Research，2000年第28卷第12期，及其部分译文，复印件共17页；
证据2：“Detection of Viable Mycobacterium tuberculosis by Reverse Transcriptase-Strand Displacement Amplification of mRNA”，T.J.Hellyer等人，JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY，1999年03月第37期，第518-523页，及其部分译文，复印件共10页；
证据3：翟中和、王喜忠、丁明孝主编，《细胞生物学》，高等教育出版社，2000年08月第1版，封面页、出版信息页、目录页及第311-312页，复印件共12页；
证据4：“Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences”，W. Henke等人，Nucleic Acids Research，1997年第25卷第19期，第3957-3958页，及其部分译文，复印件共3页；
证据5：“Betaine and DMSO:Enhancing Agents for PCR”及其部分译文，S.Frackman等人，Promega Notes，1988年第65号，第27-30页，及其部分译文，复印件共6页；
证据6：“Low temperature cycled PCR protocol for Klenow fragment of DNA polymerase I in the presence of proline”，R.lakobashvili等人，Nucleic Acids Research，1999年第27卷第6期，第1566-1568页，及其部分译文，复印件共4页；
证据7：“DNA helix destabi1ization by proline and betaine:Possible role in the salinity tolerance process”，S.V.Rajendrakumar等人，FEBS Letters，1997年第410期，第201-205页，及其部分译文，复印件共6页；
证据8：“四种新发展的体外核酸扩增技术”，刘昕，国外医学分子生物学分册，1993年第15卷第3期，第128-130页，复印件共3页；
证据9：“核酸扩增技术在结核病诊断中的应用与进展”，唐神结，中华结核和呼吸杂志，1998年09月第21卷第9期，第565-567页，复印件共3页；
证据10：“核酸体外扩增技术诊断骨结核的临床研究”，孙永生等，中华结核和呼吸杂志，1997年06月第20卷第3期，第145-148页，复印件共4页；
证据11：专利分析报告，复印件共8页。
请求人认为：第一，权利要求1-26不符合专利法第22条第3款的规定，理由在于：1）结合证据2公开的Bst DNA聚合酶的酶学性能，可以认定权利要求1与证据1的区别是权利要求1中进一步提供了一种可在环中与所述引物不同的位置处提供互补链合成起点的引物；实际解决的技术问题是通过引入环引物，以增加与模版链互补的3’-末端合成起始位点，从而提高合成效率。引入多个反应起点本身是本领域的公知常识，并已经被证据1 公开；DNA 扩增的多引物滚环扩增技术（RCA）、证据3公开的mRNA 翻译为多肽的过程均给出了启示，本领域技术人员很容易想到增加合成的起始位点并引入相应的引物；结合本专利附图，容易想到该起始位点和对应的引物应当位于环上，从而使上述图中的环状结构得到充分利用，实现增加反应效率的结果。因此，权利要求1相对于证据1与公知常识的结合不具备创造性。在此基础上，权利要求2-18与证据1的其它区别或属于本领域公知常识，或已经被证据1、4-10公开，也不具备创造性。2）权利要求19要求保护实现权利要求5 的方法的试剂盒，在权利要求5 的方法不具备创造性的基础上，将反应中所需的反应物、反应环境中所需试剂共同制成试剂盒也不具备创造性，例如证据9就公开了类似的试剂盒。在此基础上，权利要求20-26也不具备创造性。第二，本专利不符合专利法第26条第3、4款的规定，理由在于：（1）本专利说明书未充分公开如何设计内引物、环引物，其长度、起始位点、序列、制备方法，且未给出权利要求15-18、21-22、25-26所涉及的“检验序列”的明确定义，本领域技术人员通过靶序列也不能确定检验序列的长度、位置、具体结构、顺序、制备方法或者性质。（2）证据11证明按照本专利的技术方案，目标序列不能被成功扩增。（3）权利要求1中针对“内引物”和“环引物”的功能性限定得不到说明书的支持。（4）权利要求4中“和每种引物有关的上述任意区域”、权利要求17、19、23、25 中“与第一/二引物有关的任意区域”指代不清，导致权利要求4-6、17-26的保护范围不清楚。
经形式审查合格，国家知识产权局于2019年04月01日受理了上述无效宣告请求并将无效宣告请求书及证据副本转给了专利权人，同时成立合议组对本案进行审查。
专利权人针对上述无效宣告请求于2019年05月17日提交了意见陈述书，以及如下反证：
反证1：“扩增鸡脂蛋白脂酶基因外显子引物验证与分析”，王敏强，吉林农业大学学报，2007年第29卷第5期，第503-506页，复印件共4页；
反证2：“PCR引物设计及软件使用技巧”，张新宇等人，生物信息学，2004年第4期，第15-18、46页，复印件共5页。
专利权人认为：（1）本专利方法引入环引物之后，与证据1相比取得了预料不到的技术效果，例如，大大增强了LAMP法反应效率、更清楚地鉴定野生型和突变型的反应速率差异、显著改善反应特异性等，本专利说明书已经详细记载了上述技术效果，而请求人列举的公知常识并未提供与这些技术效果有关的启示。因此，权利要求1相对于证据1与公知常识的结合具备创造性。同理，其余权利要求也具备创造性。证据3仅涉及多肽翻译过程，本领域技术人员知道，其与本专利所关注的DNA合成或扩增无关；证据4-10仅涉及PCR，也与本专利的方法无关，均无法与证据1结合。（2）本专利保护用于合成或扩增核酸的方法、检测方法及相应的试剂盒，该方法包括多个步骤。针对该合成或扩增核酸的方法及检测方法，说明书已详细公开了如何实施这些步骤，由这些步骤即可合成或扩增核酸，或检测出样品中的靶核苷酸序列，实施例也已提供相应证明，因此说明书对于权利要求所主张的方法及试剂盒的公开是充分的。本领域公知引物设计的方法和标准。证据11为请求人单方作出，真实性存疑，以此质疑说明书公开不充分的证据，与法无据，且存在诸多自相矛盾之处，应当不予采纳。权利要求1为方法权利要求，并不适用请求人所引用的《专利审查指南》的内容。本领域技术人员结合本专利说明书内容及证据1等现有技术，足以确定上述权利要求所限定的范围是清楚的。
国家知识产权局本案合议组于2019年05月23日向双方当事人发出了口头审理通知书，定于2019年07月09日举行口头审理，同时将专利权人于2019年05月17日提交的意见陈述书及其反证转送给请求人。
口头审理如期举行，请求人委托的北京中伦律师事务所代理人程芳、公民代理申洪杰、仇真，专利权人委托的北京市磐华律师事务所代理人董巍、谢栒、公民代理张晨、专利权人公司代表砂田亚津子及翻译出席了本次口头审理，双方当事人对对方出庭人员的身份和资格无异议，对合议组成员无回避请求。本案合议组对本无效宣告请求的无效理由和证据逐一进行了调查，双方当事人充分陈述了意见。
在口头审理过程中，请求人当庭提交了证据1-4、6-10的图书馆证明文件，其中记载上述9份证据的公开时间分别为2000年06月15日、1999年03月、2000年08月、1997年10月01日、1999年03月15日、1997年06月30日、1993年05月、1998年09月12日、1997年06月，同时当庭提交了证据11的原件，其上盖有请求人广州迪澳生物科技有限公司印章；专利权人不认可证据1-2、4-7的真实性和公开时间，认可请求人提交的部分译文的准确性；认可证据3、8-10的真实性、合法性以及公开时间；不认可证据11的真实性、合法性。专利权人当庭提交了反证1-2的图书馆证明文件，请求人认可上述反证的真实性，但均不认可其与本案的关联性。
合议组释明本专利的申请日为2000年03月28日，适用1992年09月04日第一次修正的专利法和1992年12月12日第一次修正的专利法实施细则，因此无效请求书中记载的本专利权利要求4-6、17-26不符合专利法第26条第4款有关权利要求应当清楚的规定的理由在法律适用上有误。请求人表示同意，并明确根据其记载的具体理由改正为权利要求4-6、17-26不符合专利法实施细则第20条第1款的规定，其余理由与请求书的记载一致。专利权人对此表示认可。
请求人的证人张影出庭，双方当事人及合议组对相关事实进行了询问，张影明确其独立完成了证据11的专利分析报告及相应的实验；请求人强调该报告用于证明采用本发明的方法无法实现除本案说明书具体实施方式以外的序列的有效扩增；专利权人对张影的身份无异议，认为其学历未经证明，并且强调证据11相应实验设计不严谨。对此，请求人认为，所有PCR反应均采用通用试剂盒，即默认其反应条件应当一致，因此在实验设计时仅替换靶标序列即可，其它方面也均不存在问题。
至此，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
（一）法律适用
本专利的申请日为2000年03月28日，适用1992年09月04日第一次修正的专利法和1992年12月12日第一次修正的专利法实施细则。
（二）审查基础
本决定以本专利授权公告的文本作为审查基础。
（三）关于证据
1、关于证据1-11和反证1-2
证据1-2、4、6-7属于外国期刊文献，请求人在提出无效宣告请求时提交了该文献的正文全文复印件及部分中文译文，又于口头审理当庭提交了前述证据的图书馆证明文件，其中包含了相应的出版信息页或者图书馆出具的出版信息；专利权人强调请求人在提出无效宣告请求时并未提交相应的出版信息页或者图书馆出具的出版信息，同时图书馆自身的证明力有限，导致其出具的证明材料亦不足以证明前述证据的真实性和公开时间，但是认可译文准确性；合议组经核实前述图书馆证明文件，在没有相反证据的情况下，认可前述证据的真实性和公开时间。专利权人认可请求人提交译文的准确性，合议组对此也予以确认。
证据3属于国内教科书，证据8-10属于国内期刊文献，专利权人认可前述证据的真实性、合法性以及公开时间，合议组对此予以确认。
证据5属于外国期刊文献，请求人仅在提出无效宣告请求时提交了该文献的正文全文复印件及部分中文译文，并未提交原件或者其它证明其真实性的文件，专利权人不认可其真实性和公开时间；在无相关证据证明的情况下，合议组无法确认其真实性。
以上证据1-4、6-10的公开时间均在本专利优先权日2000年09月19日之前，可以作为本专利的现有技术文献用于评判发明创造性。
反证1-2属于国内期刊文献，请求人认可前述反证的真实性，但是强调前述反证的公开时间均在本专利优先权日之后，不属于本专利的现有技术，由此不认可其与本案的关联性。对此，合议组确认前述反证的真实性，同时认为专利权人提供前述反证并非用于证明现有技术的状况，而是为了证明核酸合成领域一直以来的技术水平，因此与本案的技术内容具有关联性。因此合议组认可反证1-2的真实性、合法性和关联性。
2、关于证据11以及证人证言
专利人认为，证据11是由请求人单方提供的实验数据，而并非是由有资质的权威机构出具的实验报告，且实验设计存在如下缺陷：一是靶标序列改变后没有相应地改变实验条件，二是引物设计存在明显缺陷，例如其中第一个引物的3’端自身成环，不适合作为引物使用，三是反应时间过短，少于本发明实施例采用的反应时间，四是第一套序列对应的模板序列有误，故有理由怀疑该证据在内容上的客观真实性。请求人则强调，证据11记载的实验在请求人广州迪澳生物科技有限公司的实验室进行，对其实验步骤有严格要求，且有实验操作者本人在口头审理当庭提供证人证言加以确认，足以保证实验过程和结果的真实性；该实验并非重复本专利说明书的具体实施方式，而只是验证该专利保护的方法是否针对其它靶序列的扩增有效，实验结果显示并不能实现扩增；同类核酸扩增试剂盒通常采用相同的扩增条件，因此不需要改变反应条件。同时，证人在作证时明确实验中采用的引物是由其本人手工设计的。
对此，合议组认为：(1)从形式上看，证据11是用于验证本专利的方法扩增靶序列效果的实验方案及相应数据，而实验操作者兼证人张影为本案无效请求人的公司员工，与请求人具有利害关系，专利权人对证人作出的实验数据的真实性提出质疑，在没有其他佐证的情况下，证据11中实验数据的真实性无法确认。
(2)从实体上看，即便考虑证据11的内容，其实验设计也存在瑕疵，导致实验结果无法证明待证事实。
首先，根据本专利说明书的记载，所属领域技术人员可以确定本发明采用特异识别靶标基因序列上六个特异性片段的四条引物以及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在等温条件下进行核酸扩增，并且使链置换DNA的合成不停地自我循环，同时引入环引物以便增加核酸合成的起点数量，提高扩增效率；扩增得以实现并加速的关键在于一系列引物的设计（参见说明书第11页第22行-第37页第12行）。就此而言，生物技术领域公知引物自身不应存在互补序列，连续互补的碱基通常应该要少于4个，而证据11中针对结核分枝杆菌核酸第2364836-2365068的核酸序列所设计的引物FA-1自身在3’端存在连续5个碱基互补（如下图所示），
导致其违背了引物设计的一般原则，容易出现引物自身成环的缺陷，而证人张影作为相应实验的独立完成者，主张其中的引物均由其本人手工设计，且并未提供上述引物设计缺陷的合理解释，使得所属领域技术人员对于该引物以及采用同样方式设计的其它引物的科学性和有效性产生合理怀疑，直接导致证据11的证明力存疑。
其次，证人主张为了证明本专利保护的技术方案所能获得的技术效果，证据11在实验设计上有意与本专利相一致，即采用了与本专利授权文本的权利要求及实施例1完全相同的实验条件；但是在反应时间的选择上却由本专利说明书实施例1的“1小时”（参见图6-8）缩短为“45分钟”，且证人也未明确上述实验设计缺陷的合理解释，所属领域技术人员有理由怀疑其无法扩增的原因系实验设计本身的缺陷所致，而非本发明的技术方案无法实现。可见，即使考虑证据11的内容，其也不能证明本专利说明书不符合专利法第26条第3款的规定。
（三）关于专利法第26条第3、4款
专利法第26条第3款规定，说明书应当对发明或者实用新型作出清楚、完整的说明，以所属技术领域的技术人员能够实现为准。
如果所属领域技术人员按照说明书记载的内容，不需要创造性的劳动，就能够再现发明的技术方案，解决其技术问题，并且产生预期的技术效果，则说明书满足充分公开的要求。
专利法第26条第4款规定，权利要求书应当以说明书为依据，说明要求专利保护的范围。
在判断权利要求是否得到说明书的支持时，应当在所属领域技术人员所掌握的普通技术知识的基础上，结合说明书的全部内容予以考虑，而不是仅考虑说明书具体实施方式的内容。
一般而言，与发明相对于现有技术的改进之处不相关或关联性不大的技术手段通常属于现有技术的范畴，所属领域技术人员容易知晓其替代方式并预见其技术效果，如果说明书中针对该技术手段的公开足以达到使所属领域技术人员能够概括得出并预期到其相应技术效果的程度，则权利要求通常能够得到说明书的支持。
1、请求人主张，本专利说明书对于“内引物”、“环引物”的技术内容公开不充分，相应的权利要求得不到说明书的支持。
对此，合议组认为，根据说明书的记载，本专利的发明目的在于提供一种有效改善靶核酸序列的互补链合成效率的方法，并以此为基础提供了相应的靶核酸序列的检测方法以及相应的试剂盒，其原理是利用了环引物对于多核苷酸LAMP扩增的加速作用（参见本专利说明书第2页第10-17行）。相应的，权利要求1-10保护合成多核苷酸的方法、靶核酸序列的检测方法以及相应的试剂盒。
根据说明书公开的信息，本发明的方法是根据靶基因的六个区域设计出四条引物，内引物在聚合酶的驱动下结合靶序列启动核酸合成，形成环状结构；外引物通过链置换核酸聚合酶的作用置换下内引物合成的核酸链并且合成自身核酸，被置换的链自身形成茎-环结构接着与内引物结合进行扩增和链置换，由此经过滚环扩增之后形成的产物周而复始地插入靶序列的不同长度的茎-环结构的核酸链，实现了靶序列的扩增。为了提高反应速度，还引入两条环引物，环引物与合成过程中形成的环状区域互补，增加了在LAMP反应中DNA合成的起点数量，从而改善扩增效率。对此，具体实施方式中验证了利用发明保护的扩增方法能够实现λDNA、SRY基因的加速扩增，并可用于检测λDNA的突变，由此证明上述方法能够有效改善靶核酸序列的互补链合成效率，并检测核酸序列突变（参见本专利说明书第39-48页实施例1-4及图4-17）。其中，针对内引物、环引物，相应的实施例（即实施例1-4）中分别做了例举，并验证了实施的效果。
综上所述，本发明对于其反应原理和步骤进行了清楚的阐释，而且在实施例里进行了验证，证明其能够有效改善靶核酸序列的互补链合成效率，并检测核酸序列突变（参见本专利说明书第39-48页实施例1-4及图4-17）。根据说明书公开的内容，本领域技术人员理解本发明是在传统核酸扩增技术的基础上进一步开发的核酸扩增方法，所属领域技术人员基于本发明核酸扩增反应的原理，结合本专利给出的实例以及本领域公知的核酸扩增或合成方法（例如，本专利背景技术中介绍的PCR方法及其它常见的核酸合成方法），有能力设计由靶序列正义链和反义链的两个特异区域组成且同时和靶序列双链互补的两条内引物、与内引物前端序列互补的两条外引物，并通过本专利说明书示例的实验方案加以选择验证。尽管对于技术效果的公开采用了示例的方式，即以具体实施方案形式提供的实验数据仅涉及特定的内引物和环引物，但是由于针对与上述示例有所不同的靶核酸序列，根据其前述功能原理亦能够设计出相应的内引物和环引物，并发挥各自基本相同的作用，基于此，说明书中记载的上述实验数据已经使得所属领域技术人员确信发明的方法能够实现对靶核酸序列的有效扩增，请求人以此主张本专利不符合专利法第26条第3款规定的理由不成立。请求人以此理由进一步主张权利要求1-26得不到说明书支持、不符合专利法第26条第4款规定的无效理由也不成立。
2、请求人还主张，本专利说明书对于“检验序列”的技术内容公开不充分。
对此，合议组认为，根据申请文件的记载，在检测样品中的靶核苷酸序列的方法中使用的至少第一引物或第二引物，应当在其 5’-方向含有检验序列，该检验序列指的是“一种核苷酸序列，其中(i)当构成特定区域的核苷酸序列不是预测的核苷酸序列时，使用检验序列作为模板合成的互补链的 3’-末端与靶核苷酸序列或其互补链退火时会发生错配，和(ii)此错配会抑制通过使用 3’-末端作为起点而起始的互补链合成反应”（参见本专利权利要求15以及说明书第4页第21-24行）。所属领域技术人员基于以上公开的信息，可以明确在引物中设置检验序列是为了在“靶核苷酸序列不是预测的核苷酸序列”时，利用“检验序列作为模板合成的互补链的 3’-末端与靶核苷酸序列或其互补链退火时发生错配”的技术手段，实现“抑制靶核苷酸序列互补链合成反应”的技术效果，从而达到检验靶核苷酸序列中突变的目的。由此，所属领域技术人员结合本领域公知的核酸合成方法（例如，本专利背景技术中介绍的PCR方法及其它常见的核酸合成方法）中检测核苷酸突变的常规技术手段，有能力设计前述用于检验靶核苷酸序列中突变的检验序列及相应所处的引物位置，并通过本专利说明书的实验方案加以选择验证。可见，请求人以此主张本专利不符合专利法第26条第3款规定的理由不成立。
3、请求人还依据证据11主张本专利说明书公开不充分。如前所述，证据11中实验数据的真实性无法确认，且证明力存疑，难以证明本发明的技术效果，因此请求人的主张无法得到合议组的支持。
（四）关于专利法实施细则第20条第1款
专利法实施细则第20条第1款规定，权利要求书应当说明发明或者实用新型的技术特征，清楚并简要地表述请求保护的范围。
对于权利要求中的“有关”、“任意”等用词，应当结合申请文件整体公开的内容，判断其是否会导致权利要求的保护范围不清楚，避免机械地将这类用词一概归结为不清楚的用词而不允许使用。
本专利的从属权利要求4间接引用了独立权利要求1，保护一种合成多核苷酸的方法，并且进一步限定该方法中使用的两种引物“是第一引物和第二引物，至少一种引物是环引物，它可在第一引物或第二引物延伸产物中的得自每种引物的区域与和每种引物有关的上述任意区域之间提供互补链合成起点”；从属权利要求17也间接引用了独立权利要求1，保护一种检测样品中的靶核苷酸序列的方法，并且进一步限定该方法中使用的第一环引物“可在第一引物延伸产物中的得自第一引物的区域与和第一引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点”，第二环引物“可在第二引物延伸产物中的得自第二引物的区域与和第二引物有关的任意区域之间提供互补链合成起点”。
无效请求人强调，根据上述记载，不能确认权利要求4、17中“和每种引物有关的上述任意区域”、“和第一引物有关的任意区域”、“和第二引物有关的任意区域”的含义，导致其保护范围限定不清楚。基于类似理由，权利要求5-6、18-26的保护范围也不清楚。
对此，合议组认为，在从属权利要求4或17所引用的独立权利要求1中限定了“至少一种引物，所述引物可在环中与 2 中所述的引物不同的位置处提供互补链合成起点，所述环是通过模板多核苷酸和/或使 2 中所述的引物与模板多核苷酸退火而产生的延伸产物形成的”，根据前述提高核酸扩增反应速度的原理可知，在LAMP反应中引入引物，特别是环引物，是利用了环引物与合成过程中形成的环状区域互补，以便增加在LAMP反应中核酸合成的起点数量，从而改善扩增效率。也就是说，基于增加核酸合成的起点数量的目的，引入的引物只要与核酸合成过程中形成的环状区域互补就可以作为改善扩增效率的候选引物，并通过本专利说明书的实验方案加以选择验证即可，并不需要特别要求引入的引物对应于核酸合成过程中形成的环状区域的特定位置，可见，所属领域技术人员能够理解，前述权利要求中限定的“在第一引物或第二引物延伸产物中的得自每种引物的区域与‘和每种引物有关的上述任意区域’之间”、“在第一引物延伸产物中的得自第一引物的区域与‘和第一引物有关的任意区域’之间”、“在第一引物延伸产物中的得自第一引物的区域与‘和第二引物有关的任意区域’之间”所表述的含义，所述表述不会导致权利要求的保护范围不清楚。因此，对于请求人的上述无效理由，合议组不予支持。
（五）关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指同申请日以前已有的技术相比，该发明有突出的实质性特点和显著的进步。
评价一项发明是否具备创造性时，应将其与最接近的现有技术比较以确定区别技术特征和实际解决的技术问题，然后考察包括本领域公知常识在内的现有技术整体上是否给出了将上述区别技术特征应用到该最接近的现有技术中以解决其存在的技术问题的启示。当请求保护的技术方案与现有技术相比存在区别技术特征，同时没有证据表明作为该区别技术特征的技术手段可以显而易见地被本领域技术人员用来解决本申请实际解决的技术问题时，不应当认定该技术方案相对于所述现有技术是显而易见的。
权利要求1要求保护一种合成多核苷酸的方法，并且限定了该方法所包括的步骤以及所用的组分。如前所述，结合本发明说明书对于发明原理的相关记载，该方法根据靶基因的六个区域设计出两条内引物FA、RA和两条外引物F3、R3，其中内引物在聚合酶的驱动下结合靶序列启动核酸合成，并形成环状结构，外引物通过链置换核酸聚合酶的作用置换下内引物合成的核酸链并且合成自身核酸，被置换的链自身形成茎-环结构接着与内引物结合进行扩增和链置换，如此经过滚环扩增之后形成的产物周而复始地插入靶序列的不同长度的茎-环结构的核酸链，实现了靶序列的扩增；同时，引入两条与合成过程中形成的环状区域互补的环引物，以便增加扩增反应中DNA合成的起点数量，从而改善了扩增效率。
请求人主张，权利要求1相对于证据1和公知常识的结合不具备创造性。
证据1公开了一种DNA环介导等温扩增的方法——LAMP法（参见其译文摘要、第2、4、7页及图1A），该方法是利用DNA聚合酶，通过能够识别靶核酸序列上六段序列的四种特殊引物，合成靶核苷酸，该方法包含混合多种组分，并在允许DNA聚合酶发挥作用的条件下进行保温，其中所用的模板链具有互补核苷酸序列，当其互补核苷酸序列杂交时能与自身退火形成茎环结构；并且，当模板链的3’末端与自身退火形成环时，其3-末端可成为使用其自身为模板的互补链合成的起点，其反应体系中包含两对引物，其中两个内引物FIP、BIP（即分别对应于本专利的内引物FA、RA）的F2和B2区域分别与模板核苷酸链的环区域不同位置F2c和B2c退火，提供3’-末端互补链合成起点；两个外引物F3、B3（即分别对应于本专利的外引物F3、R3）可以与模板核苷酸链上不同于内引物的位置退火，提供互补链的合成起点，外引物F3比FIP少一些碱基且浓度更低，其与靶标DNA中的F3c缓慢杂交并启动链置换DNA合成；反应体系中还包含Bst DNA聚合酶，也包含互补链合成的底物。
可见，权利要求1与证据1的区别在于，权利要求1保护的方法中采用了至少一种引物，所述引物可在环中与（2）中的扩增所用引物不同的位置处提供互补链合成起点，所述环是通过模板多核苷酸和/或使（2）中的扩增所用引物与模板多核苷酸退火而产生的延伸产物形成的，而证据1并未使用该引物。如前所述，根据本专利说明书的记载，本专利说明书在具体实施方式中验证了利用发明保护的扩增方法能够实现λDNA、SRY基因的加速扩增，由此证明上述方法能够有效改善靶核酸序列的互补链合成效率（参见本专利说明书第39-48页实施例1-4及图4-17）。可见，权利要求1的技术方案通过引入引物（特别是环引物），以增加与模版链互补的3’-末端合成起始位点，实际解决了改善核酸扩增效率的技术问题。
请求人主张基于证据1、公知常识性证据3以及其它公知常识的教导，并结合本专利附图的印证，容易想到权利要求1的技术方案。
对此，合议组认为，首先，如前所述，证据1公开的DNA环介导等温扩增法（LAMP）中使用的两个内引物FIP、BIP和两个外引物F3、B3分别对应于本专利的内引物FA、RA和外引物F3、R3，都是进行LAMP扩增反应所必须的引物，并非用于增加核酸扩增的起始位点，并未改善扩增效率；该证据公开的扩增方法也未使用任何用于增加核酸扩增的起始位点的其它引物，因此该证据完全没有教导在LAMP扩增中引入反应中所形成的环的引物作为核酸合成起点。
其次，公知常识性证据3作为细胞生物学教科书，公开了真核和原核细胞中多聚核糖体在蛋白质合成中的机制以及mRNA翻译为多肽的生物学过程，其中并不涉及利用蛋白质工程技术合成蛋白质的信息，更不涉及体外核酸扩增方法。由于该公知常识性证据仅涉及将核酸翻译为蛋白质的生物学过程，其中引入的多个起始位点是指mRNA翻译的起始位点，与核酸合成的过程无关，并未教导引入核酸合成的多个起始位点，因此该证据完全没有教导在核酸扩增中引入引物作为核酸合成起点。
再次，请求人还主张引入多个反应起点本身是本领域的公知常识，并强调已知的多引物滚环扩增技术（RCA）给出了相应的技术启示，结合本专利附图，容易想到该起始位点和对应的引物应当位于环上，从而使上述图中的环状结构得到充分利用，实现改善反应效率的结果。对此，合议组认为，尽管本领域公知引物设计的一般方法，也公知用于核酸扩增的引物不同有可能导致扩增的起始位点存在差异，但是基于目前的证据1和公知常识性证据，尚不足以认定“在核酸扩增反应中引入多个反应起点”、“多引物滚环扩增技术（RCA）”属于本领域的公知常识；同时，本专利附图既非现有技术证据，也非公知常识性证据，不能用于证明“在LAMP方法形成的环上利用引物引入新的核酸扩增的起始位点”属于本领域的公知常识。
综上所述，所属领域技术人员没有动机在证据1的技术方案中引入其它引物作为核酸合成起点，更没有动机针对该证据LAMP方法的中间环状结构产物设计引物，用于改善反应效率；同时根据本专利说明书的记载，使用上述环引物可以有效改善λDNA、SRY基因的合成效率，即权利要求1的技术方案取得了有益的技术效果。
请求人针对权利要求2-18的创造性评述中，还使用了证据4、6-8。对于上述证据，合议组认为，证据4公开了甜菜碱对DNA扩增的促进作用（参见其译文第1页摘要），证据6公开了脯氨酸用于PCR缓冲添加剂的用途（参见其译文第1页最后一段），证据7公开了脯氨酸和甜菜碱对DNA螺旋的去稳定作用（参见其译文第1页摘要），请求人使用它们是为了证明从属权利要求10中限定的几种解链温度调节剂属于现有技术，均未公开本专利权利要求1与证据1的区别技术特征，也未给出将上述区别技术特征应用于证据1的技术启示；证据8公开了连接酶链式反应（LCR）的原理（参见其第128页左栏最后一段以及图1），请求人使用该证据是为了证明从属权利要求13、14、16、18的附加技术特征属于现有技术，未公开本专利权利要求1与证据1的区别技术特征，也未给出将上述区别技术特征应用于证据1的技术启示；另外，请求人在无效理由中还提到使用证据2证明Bst DNA聚合酶的酶学性质，该证据公开了一种用于检测结核分枝杆菌α-抗原mRNA的逆转录酶链置换扩增系统（参见其译文第1页摘要），未公开本专利权利要求1与证据1的区别技术特征，也未给出将上述区别技术特征应用于证据1的技术启示，因此在考虑以上证据的基础上，本专利权利要求1仍然具有创造性，符合专利法第22条第3款的规定。
权利要求2-18直接或者间接引用了权利要求1，相对于上述证据的结合而言也具有创造性，符合专利法第22条第3款的规定。
权利要求19保护用于扩增靶核苷酸序列的试剂盒，并且限定了试剂盒中一系列引物的序列结构特征、聚合酶的种类以及底物组分。由前述分析可知，该权利要求所限定的试剂盒中第一环引物和第二环引物的序列结构特征均构成了与证据1的区别，而证据9-10涉及与本专利不同的核酸扩增试剂盒，请求人使用这两份证据只是为了证明核酸扩增试剂盒这个主题属于现有技术，均未公开本专利权利要求1与证据1的区别技术特征，也未给出将上述区别技术特征应用于证据1的技术启示，因此基于权利要求1类似的理由，该权利要求也具有创造性，符合专利法第22条第3款的规定。权利要求20-22引用了权利要求19，相对于上述证据的结合而言也具有创造性，符合专利法第22条第3款的规定。
权利要求23保护用于扩增靶核苷酸序列的试剂盒，并且限定了试剂盒中一系列引物的序列结构特征、聚合酶的种类以及底物组分。由前述分析可知，该权利要求所限定的试剂盒中第一环引物和第二环引物的序列结构特征均构成了与证据1的区别，基于权利要求1类似的理由，上述权利要求也具有创造性，符合专利法第22条第3款的规定。权利要求24引用了权利要求23，相对于上述证据的结合而言也具有创造性，符合专利法第22条第3款的规定。
权利要求25保护测定靶核苷酸序列中的特定核苷酸是否为第一核苷酸或第二核苷酸的方法，并且限定了检测步骤以及所用的一系列引物的序列结构特征、聚合酶的种类、底物组分以及受试多核苷酸。由前述分析可知，上述权利要求所限定的第一环引物和第二环引物的序列结构特征均构成了与证据1的区别，基于权利要求1类似的理由，该权利要求也具有创造性，符合专利法第22条第3款的规定。权利要求26引用了权利要求25，相对于上述证据的结合而言也具有创造性，符合专利法第22条第3款的规定。
基于以上事实和理由，本案合议组作出如下审查决定。
三、决定
维持第01819083.9号发明专利权有效。
当事人对本决定不服的，可以根据专利法第46条第2款的规定，自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。根据该款的规定，一方当事人起诉后，另一方当事人可以作为第三人参加诉讼。
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